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《吉林农业大学》 2017年
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水貂阿留申病毒VP2重组蛋白与天然纯化抗原对比分析

于凯  
【摘要】:水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)引起的一种慢性进行性传染病,是阻碍毛皮发展的三大传染病之一,AMD发病率约75%,直接死亡率可达30%。每年给水貂养殖业造成的经济损失难以估量。由于该病特殊的致病机理,目前还没有针对预防AMD的可靠药物,唯一的控制措施就是筛选并扑杀AMD阳性水貂。对流免疫电泳(CIEP)是公认检测AMD的金标准,其原理是抗原抗体在电场的作用下相向运动,两者相遇之后会形成一条清晰的白色沉淀线。形成沉淀线的为阳性,反之则为阴性。而抗原在检测AMD中具有重要的作用,其结果的准确性、反应的灵敏性主要由抗原的质量决定,因此抗原的研究和制备对AMD的检测工作有着重要的意义。本实验目的是筛选出一种成本低廉、操作便捷的抗原制备方法,为AMD的检测和AMD胶体金试纸条的制备提供基础。主要试验结果如下:通过对AMDV-G株的VP2基因序列进行原核表达,预计条带扩增大小为1944bp,从而构建原核表达质粒PMAL-c4x-VP2a,通过SDS-PAGE结果显示其分子量大小与文献报道一致;通过Western blot结果显示,该蛋白可以与AMD阳性血清特异性结合;对表达的蛋白进行直链淀粉树脂亲和层析纯化,从而得到麦芽糖结合融合蛋白,最终1 L的培养物可以得到80 mg的重组蛋白;根据GenBank发表的AMDV-G株全基因组序列,利用生物学软件对VP2基因主要抗原表位进行序列分析,设计并合成一对特异性引物,预计条带扩增大小为710 bp,与载体pEASY-Blunt Zero连接后,通过PCR、双酶切及序列测定,将鉴定正确的重组阳性质粒与原核表达载体PMAL-p5x连接,进而构建PMAL-p5x-VP2b原核表达质粒,通过SDS-PAGE显示其分子量大小为23 kDa;Western blot结果表明,该蛋白可以与AMD阳性血清特异性的结合;对表达的蛋白进行渗透休克法快速分离纯化,1 L的培养物最终可以得到120 mg的重组蛋白;利用Bac-to-bac表达系统对AMDV-G株的VP2全基因进行真核表达,将VP2基因与转移载体pFast BacHT-B连接,并转化到DH10Bac感受态细胞,通过与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid发生转座,挑取白斑进行大量培养后提取转座子Bacmid-VP2,通过PCR鉴定后将正确的转座子Bacmid-VP2转染到生长至对数期的sf9细胞中,27℃培养箱培养72 h,收获部分病变的细胞并避光保存,同时对发生病变的细胞进行免疫荧光实验,结果显示,荧光信号强;通过病毒空斑实验对病毒筛选纯化;对表达的蛋白通过镍柱纯化后,1 L的细胞培养液可以获得100 mg的重组蛋白;对传统的AMDV抗原采用超滤管浓缩法进行纯化,其抗原纯度得到提高,将血清稀释至16倍后依旧可以检出,提高了检测的敏感性;利用生物学软件分析,原核表达系统中,PMAL-c4x-VP2a表达的目的蛋白占总蛋白的49.55%,而PMAL-p5x-VP2b表达的蛋白占总蛋白的71.07%;将三种重组蛋白抗原与AMDV抗原对临床上240个血清样本进行CIEP检测,通过对比,纯化的AMDV抗原其检测敏感性、特异性最好。而重组蛋白中,检出率最高的为真核表达的蛋白,与AMDV抗原相对比,其符合率达91.2%;而原核表达的两种蛋白,短片段表达的蛋白其敏感性及表达量都高于长片段所表达的蛋白,两者之间的符合率为85.3%;而短片段表达的蛋白与AMDV抗原的检出符合率达87.2%。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张蕾;柴秀丽;冯佩平;张海玲;胡博;白雪;赵建军;冯卓;王振军;徐磊;闫喜军;吴威;;水貂阿留申病基因工程诊断抗原的制备[J];中国畜牧兽医;2015年07期
2 邵西群;章秀婷;于淼;贾博寅;岳志刚;杨福合;;貉狐源阿留申病病毒的感染检测与基因特征[J];中国兽医科学;2015年06期
3 王振军;吴威;闫喜军;呼延良浩;纪银铃;侯海良;张蕾;李明霞;;水貂阿留申病分子生物学及防控技术研究进展[J];特产研究;2014年01期
4 陈晓娟;闫少春;邵国;;蛋白表达系统的研究进展[J];包头医学院学报;2014年03期
5 张蕾;胡博;王振军;朱春生;孙彦刚;闫喜军;吴威;;我国首次证实貉感染水貂阿留申病毒[J];病毒学报;2013年06期
6 秦绪伟;李富金;赵远;;貉子阿留申病的诊断[J];北方牧业;2013年19期
7 刘培言;;水貂阿留申病的防治[J];山东畜牧兽医;2013年08期
8 宋月峰;宋晓东;王晓龙;;水貂阿留申病的防治[J];中国动物保健;2013年04期
9 杨莘;易立;王建科;罗彬;程世鹏;;水貂阿留申病毒结构蛋白与非结构蛋白在疾病诊断与疫苗研发中的应用[J];动物医学进展;2011年01期
10 徐磊;闫喜军;张蕾;柴秀丽;赵建军;张海玲;高晗;白雪;;水貂阿留申病毒VP2基因的原核表达及初步应用[J];中国农学通报;2010年08期
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 张卓;水貂阿留申病毒分离鉴定及其致病性研究和诊断方法的建立[D];东北农业大学;2015年
2 王崧;新型促血小板生成融合蛋白的基因工程制备及其作用机制研究[D];第三军医大学;2013年
3 李艳伍;貂阿留申病病毒流行毒株分子特征及其VP2基因重组杆状病毒免疫特性研究[D];南京农业大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 黄盼盼;水貂阿留申病检测抗原的制备及间接ELISA检测方法的建立[D];吉林大学;2015年
2 李晶;检测水貂阿留申病Dot-ELISA方法的建立及初步验证[D];吉林农业大学;2015年
3 万洪理;我国部分地区水貂阿留申病血清学调查[D];吉林农业大学;2015年
4 张秀丽;水貂阿留申病流行病学调查及快速检测方法建立[D];吉林农业大学;2014年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 庄金秋;梅建国;王玉茂;姚春阳;莫玲;沈志强;;水貂阿留申病毒最新检测方法研究进展[J];现代畜牧兽医;2017年11期
2 庄金秋;梅建国;王玉茂;姚春阳;莫玲;沈志强;;水貂阿留申病毒实验室检测方法研究进展[J];中国动物检疫;2017年10期
3 许秋;姜彦平;吴纪国;杨瑞梅;单虎;;水貂阿留申病PCR检测方法的建立及应用[J];黑龙江畜牧兽医;2017年12期
4 刘俊平;王振军;罗国良;赵志刚;王春霞;林志军;张淼;程悦宁;栾杨;侯海良;吴威;;水貂阿留申病对水貂产仔性能及成活数量的影响[J];黑龙江畜牧兽医;2017年12期
5 陈春野;刘剑;朱瑞;李姝璇;叶江辉;王玮;潘德全;徐飞海;程通;夏宁邵;;大肠杆菌可溶性表达人鳞状上皮细胞癌抗原的制备及应用[J];生物技术通报;2017年09期
6 于凯;倪佳;冯二凯;万洪理;陈立志;;水貂阿留申病诊断抗原研究概述[J];动物医学进展;2017年04期
7 渠静;郑媛;任晓曦;郑焱;杨慧;张建亮;;蛋白磷酸酶2A Cα在昆虫杆状病毒中的表达及活性[J];中国老年学杂志;2017年07期
8 张鑫;程军军;姜勋平;刘桂琼;;鸡神经肽Y(NPY)基因在毕赤酵母中的表达[J];安徽农业大学学报;2017年01期
9 许诺;贾俊龙;王维;朱玉博;王雪晗;白文林;罗光彬;;慢病毒介导EGFP在小鼠胚胎的体外表达[J];沈阳农业大学学报;2016年05期
10 何玉华;孟岩;;辽宁省某地区水貂阿留申病的诊断与调查[J];中国兽医杂志;2016年06期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 张卓;水貂阿留申病毒分离鉴定及其致病性研究和诊断方法的建立[D];东北农业大学;2015年
2 许杨;GH促血小板生成机制分析及dTMP-GH对辐射损伤小鼠的救治作用研究[D];第三军医大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 于凯;水貂阿留申病毒VP2重组蛋白与天然纯化抗原对比分析[D];吉林农业大学;2017年
2 朱伟英;奶山羊干酪性淋巴结炎病原的分离鉴定及血清学调查[D];西北农林科技大学;2017年
3 万洪理;我国部分地区水貂阿留申病血清学调查[D];吉林农业大学;2015年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘春菊;任炜杰;王志亮;;杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域应用的研究进展[J];中国畜牧兽医;2013年09期
2 曹东艳;柳倩;贺晓云;梅晓宏;;源于GAP启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展[J];食品安全质量检测学报;2013年04期
3 热依汗古丽·阿里木;毛新芳;刘忠渊;;黄粉虫抗菌肽在大肠杆菌中表达条件优化及活性分析[J];生物工程学报;2013年06期
4 范翠英;冯利兴;樊金玲;果德安;刘璇;;重组蛋白表达系统的研究进展[J];生物技术;2012年02期
5 李丽;朱贵明;汪坤福;张鹏霞;;RPL30基因哺乳动物表达载体的构建及其初步表达分析[J];中国老年学杂志;2012年07期
6 刘友;姜树原;黄丽华;王双;张胜;周立社;邵国;;人DNMT3B7原核表达载体的构建和表达[J];包头医学院学报;2012年01期
7 李富祥;杨仕标;艾军;周晓黎;赵文华;王金萍;;非洲马瘟病毒VP7基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达[J];中国畜牧兽医;2012年01期
8 倪佳;张蕾;柴秀丽;高晗;张海玲;赵建军;白雪;邵西群;闫喜军;;水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达[J];中国畜牧兽医;2011年09期
9 姜树原;张颜波;邹绮;罗天娇;张胜;周立社;邵国;;人DNMT3B1原核表达载体的构建和表达[J];泰山医学院学报;2011年06期
10 李向阳;张嘉保;任文郅;刘殿峰;;酵母双杂交系统在蛋白质相互作用中的应用[J];中兽医医药杂志;2011年01期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 李艳伍;貂阿留申病病毒流行毒株分子特征及其VP2基因重组杆状病毒免疫特性研究[D];南京农业大学;2012年
2 梁冬莹;ADV分离株全基因序列测定及VP2抗原表位区的表达与应用[D];东北林业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张秀丽;水貂阿留申病流行病学调查及快速检测方法建立[D];吉林农业大学;2014年
2 王振军;水貂阿留申病分子流行病学调查和间接ELISA检测方法的建立[D];中国农业科学院;2014年
3 刘红娜;水貂阿留申病毒NS1基因的分段原核表达及免疫原性研究[D];吉林农业大学;2014年
4 刘立兵;水貂阿留申病毒VP2基因的原核表达及ELISA检测方法的建立[D];吉林农业大学;2013年
5 孙见;貂源铜绿假单胞菌的分离鉴定及其环介导等温扩增检测方法的建立[D];中国农业科学院;2012年
6 桑宇;水貂阿留申病流行病学调查[D];东北林业大学;2012年
7 徐磊;水貂阿留申胶体金免疫层析诊断方法的初步建立[D];中国农业科学院;2010年
8 史迎秋;水貂养殖及产品初加工技术规程的研究与制定[D];东北林业大学;2010年
9 刘爽;Dot-ELISA检测鸭疫里默氏杆菌抗体的建立及应用研究[D];四川农业大学;2009年
10 刘俊;MGB荧光定量PCR鉴别检测猪瘟病毒及其动态分布规律研究[D];西南大学;2009年
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1 汪开治;利用植物根溢泌生产重组蛋白[J];生物技术通报;1999年05期
2 吴海涛,胡云龙,陈松,刁振宇,金丽娜,李洁,张双全;重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的影响因素[J];中国生物工程杂志;2004年08期
3 柴勇;;可用于回收重组蛋白的双酶系[J];生物技术通报;1987年05期
4 李思经;;小分子将替代重组蛋白吗[J];生物技术通报;1989年03期
5 孙国凤;重组蛋白的委托生产[J];生物技术通报;1992年12期
6 孙国凤;;用植物细胞生产重组蛋白[J];生物技术通报;1993年01期
7 勾蓝图;杨金亮;;用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达新技术[J];生物技术通讯;2012年06期
8 杨运桂,童芹,胡泰山,钱友存,杨胜利,龚毅;新型大肠杆菌裂解系统在重组蛋白回收中的应用(英文)[J];生物化学与生物物理学报;2000年03期
9 姚振宇,吕昌龙,于秉治,曹雅明;CILP-MBP基因重组蛋白的亚克隆构建及温度可溶性诱生表达[J];中国免疫学杂志;2002年05期
10 陈爱春;彭伟;汪生鹏;;亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用[J];中国生物工程杂志;2012年12期
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1 卫红飞;王丽颖;;重组蛋白发酵[A];东北三省生物化学与分子生物学学会2008年学术交流会论文摘要[C];2008年
2 关怡新;姚善泾;;重组蛋白的体外复性技术研究进展[A];浙江省化工学会成立五十周年庆祝大会暨第二届省(市)际化学化工科技发展研讨会论文集[C];2001年
3 潘夕春;丁国富;周红;;人TLR9受体LRR8片段在大肠杆菌中的重组表达[A];中国药理学会化疗药理专业委员会第九届学术研讨会论文摘要集[C];2008年
4 任道锋;;旋毛虫基因Ts43原核表达及重组蛋白鉴定[A];苏州市自然科学优秀学术论文汇编(2008-2009)[C];2010年
5 曹珊珊;吴开春;张英起;樊代明;;重组蛋白GX1-nrhTNFα的表达,纯化和功能研究[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
6 谭江琳;袁顺宗;彭旭;马兵;黄正根;程文广;王小娟;甘成军;贾雄飞;王庆红;贺伟峰;胡婕;张小容;胡晓红;罗高兴;吴军;;人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年
7 周晔;蒋天舒;陈燕;娄加陶;吴传勇;陈波;谷明莉;仲人前;邓安梅;;结核杆菌Ag85A重组蛋白的免疫原性研究[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年
8 李存保;王美玲;;尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)基因的克隆与原核表达[A];第三届泛环渤海(七省二市)生物化学与分子生物学会——2012年学术交流会论文集[C];2012年
9 王玉梅;孟多佳;时成波;常军亮;张宁;迟春萍;曹玉锋;于爱东;;抗戊型肝炎病毒重组蛋白P179单克隆抗体的制备及应用[A];2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会论文集[C];2011年
10 张灵霞;吴雪琼;史迎昌;梁建琴;张俊仙;;几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究[A];中国防痨协会全国学术会议大会学术报告[C];2001年
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1 刘成刚 左朝胜;复能与罗氏携手人类重组蛋白研发[N];科技日报;2006年
2 记者 姜煜;前七月本市民企进出口同比增76%[N];北京日报;2011年
3 何丽君;哈四个高技术项目通过验收[N];黑龙江经济报;2009年
4 记者 薛婧;哈尔滨再添新动力[N];黑龙江日报;2009年
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1 李妍;具有眼球屏障穿过作用的Tat PTD-Endostatin-RGD的制备、滴眼抑制眼底新生血管生成及眼部药代动力学研究[D];山东大学;2016年
2 李全;犬瘟热病毒、犬细小病毒及狂犬病毒三联多表位重组蛋白的构建及其免疫效果研究[D];中国农业大学;2017年
3 于长明;利用毕赤酵母系统表达重组蛋白[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
4 丁大勇;重组再生蛋白3的表达及抗菌活性的研究[D];吉林大学;2015年
5 孙蕊;双功能重组蛋白靶向免疫治疗肿瘤研究[D];北京协和医学院;2015年
6 刘文俊;基于逆向相变和自裂解的重组蛋白表达和纯化系统的建立与应用[D];扬州大学;2014年
7 王盛典;人白细胞介素15cDNA克隆和在大肠杆菌中高效表达及其重组蛋白的纯化[D];中国协和医科大学;1998年
8 张晶;小鼠白介素1受体拮抗剂重组蛋白的制备及其预防化疗骨髓毒副作用的研究[D];上海交通大学;2008年
9 卢爱桃;STLV-1/BV重组蛋白ELISA诊断试剂盒的研发及液相芯片诊断方法的建立[D];内蒙古农业大学;2008年
10 徐莉娟;诊治法布莱氏病的单抗及重组蛋白的研制[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 梁振东;重组蛋白A亲和介质的制备及性能和应用研究[D];江南大学;2015年
2 张易;灰葡萄孢蛋白激发子BcSpl1诱导番茄抗病机制研究[D];中国农业科学院;2015年
3 龚文芝;猪热激蛋白Gp96N端基因与猪瘟病毒E2基因重组表达及重组蛋白的免疫原性研究[D];中国兽医药品监察所;2015年
4 李达;旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫学及生物活性研究[D];东北农业大学;2015年
5 郝明强;表达HPV6型L2△E7E6重组蛋白的工程菌株构建及免疫效果评价[D];中国疾病预防控制中心;2012年
6 齐亚坤;化脓性链球菌溶血素O和人视黄醇结合蛋白的表达与纯化[D];南京师范大学;2015年
7 解帅帅;GlnRS与ArgRS多抗的制备及表达分析[D];苏州大学;2016年
8 刘会珍;拟南芥IAA7和TIR1在E.coli和果蝇S2表达系统中的表达[D];湖南农业大学;2015年
9 商鹏飞;鸡内脂素的原核表达及活性测定[D];河南农业大学;2014年
10 黄夏冰;共抑制分子VISTA胞外段重组蛋白表达及其对EAE小鼠治疗作用的研究[D];郑州大学;2016年
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