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《吉林农业大学》 2017年
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维氏气单胞菌TH0426株胞外产物免疫原性及免疫蛋白组学的初步研究

毕建飞  
【摘要】:维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A veronii)是一种人-兽-鱼共患病原菌,它普遍分布于自然环境中,能引起鱼虾等多种水生动物发病而大量死亡,部分国家已将其列为检疫项目,国内外已陆续开展了有关维氏气单胞菌的科研工作。胞外产物(Extracellular products,ECPs)是病原菌在生长发育与繁殖过程中接连不断向外环境分泌的产物,其具有良好的免疫原性,能够引起宿主产生免疫应答反应,是一种有效的保护性抗原。目前国内外还没有维氏气单胞菌胞外产物免疫效果的研究。本文以维氏气单胞菌TH0426株为实验材料,制备其胞外产物,观察胞外产物对锦鲤的免疫保护效果,同时对胞外产物进行免疫蛋白组学分析,鉴定免疫原性蛋白。首先采用超滤浓缩法制备维氏气单胞菌TH0426株的胞外产物,应用SDS-PAGE电泳对其进行初步分析,通过平板琼脂扩散法对其主要酶成分进行初步研究,对蛋白酶、脂酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脲酶、明胶酶和溶血活性进行测定,同时对锦鲤腹腔注射胞外产物测定其致病性。结果表明维氏气单胞菌TH0426株胞外产物具有脂酶、淀粉酶、蛋白酶和溶血酶活性,不具有卵磷脂酶、脲酶和明胶酶活性,对锦鲤具有明显的致病性,其LD50为391.6μg/条。对胞外产物进行免疫保护力研究。将240尾锦鲤分为四组,每组60尾。第一组免疫联合弗氏佐剂的ECPs蛋白(即ECPs),第二组免疫联合弗氏佐剂的ECPs与维氏气单胞菌TH0426灭活全菌混合剂(即FKC+ECPs),第三组免疫联合弗氏佐剂的维氏气单胞菌TH0426灭活全菌(即FKC),第四组免疫灭菌PBS缓冲液作为对照。实验前预养一周,免疫后第三周进行二次免疫,以观察在加强免疫后的锦鲤免疫指标变化。免疫期间每隔一周采血一次,每组随机选择5尾锦鲤进行尾静脉采血,采血后的锦鲤做淘汰处理,采集的血清进行白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、溶菌酶(LZM)和IgM含量的检测;首次免疫四周后,各组随机选取20尾锦鲤腹腔注射0.2mL2×106cfu/mL的维氏气单胞菌TH0426,观察各组的相对免疫保护率,并评估其免疫保护效果。结果显示免疫后各实验组锦鲤显著提高抵抗细菌的侵袭的能力,提高了免疫保护力,并且免疫ECPs的效果较佳,其相对免疫保护率达到了75%,免疫FKC+ECPs和FKC的相对免疫保护率也达到了55%和70%。各免疫指标也显示免疫ECPs后能够诱导锦鲤机体产生免疫应答反应,并能形成较高保护力。胞外产物进行了免疫蛋白组学2-DE图谱分析和2-DE凝胶的免疫印迹分析,鉴定胞外产物中具有免疫原性的蛋白,并运用PCR检测三种免疫原性蛋白在维氏气单胞菌不同分离株中的分布。实验结果表明胞外产物含有11种具有免疫原性的蛋白,分别为肽酶S8、长链脂肪酸转运蛋白、膜蛋白、溶血素样毒素、主要外膜蛋白OmpAI、麦芽糖、ABC底物结合转运蛋白和几种假设蛋白。其中三种高丰度的蛋白,膜蛋白、长链脂肪酸转运蛋白和肽酶S8在维氏气单胞菌不同分离株的分布率分别为97%(97/100)、89%(89/100)和77%(77/100)。这些免疫原性蛋白作为疫苗候选蛋白,为维氏气单胞菌胞外产物亚单位疫苗的研制提供了理论参考。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S941.4

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