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《吉林农业大学》 2017年
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犬瘟热病毒H基因与犬IL-6融合基因的克隆与原核表达

刘天宇  
【摘要】:犬瘟热(Canine distemper)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种高度烈性传染病,呈现典型的双相热型,主要侵害呼吸系统、消化系统和神经系统,表现为眼、鼻分泌物转化为粘液性或者脓性,肺部听诊呼吸音粗历等卡他性炎症,以及非化脓性脑膜-脊髓炎,并且其症状几乎为90%以上都会有,死亡率也高达6 0%-8 0%,并且该病易和其他病毒、细菌混合感染,造成大量死亡,因此常被称为“毁灭性传染病”。目前本病遍布世界各地,造成巨大的经济损失。近年来,随着生态环境发生改变、病毒也变异进化,导致CDV可感染犬科、鼬科、浣熊科、猫科、大熊猫科(猫除外)等多种动物,是当前危害养殖业和野生动物保护业的最大疫病之一。CDV基因组编码核衣壳蛋白(N)、基质膜蛋白(M)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、融合蛋白(F)和血凝蛋白(H)6个蛋白,其中,H蛋白基因由1947个核糖核甘酸组成,含有一个开放性阅读框架,其编码的H蛋白为CDV的膜表面主要糖蛋白之一,可以诱导机体产生中和抗体,在免疫中起着重要的作用,并且能吸附和识别细胞表面受体,并能协助F蛋白使CDV的囊膜与细胞膜发生融合,进而侵入宿主细胞,此外,H蛋白含有多个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,可产生特异的CTL活性,可作为预防CD基因工程疫苗中的靶基因。白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能的细胞因子,能激活靶基因,还可以作为造血源细胞、T细胞、B细胞、内皮细胞、破骨细胞等的分化和生长因子,增强自然杀伤细胞(NK)的杀伤活性等,在机体的免疫中具有重要作用,是一类天然的免疫增强剂。在医学领域商品化的人IL-6之已经用于治疗过敏性疾病、感染性疾病和肿瘤疾病等的治疗。由于IL-6不会产生免疫原性,不会发生自身免疫性疾病,克服了传统免疫佐剂一大缺点。所以可以将IL-6基因克隆到载体中,做为一种高效、安全、经济的新型免疫佐剂,其前景非常乐观。根据发表的犬瘟热病毒的基因序列设计一对引物,用犬瘟热病毒株感染Vero细胞收集病毒,用逆转录PCR(RT-PCR)方法扩增出H基因序列大小为1125bp的基因片段。扩增产物连接到pMD18-T载体中,转化,提取质粒酶切鉴定、PCR分析,重组质粒进行测序,结果显示获得基因序列与GenBanK中登录的H基因相似性为100%。再从健康犬血提取淋巴细胞,分离犬IL-6RNA,构建重组质粒pMD-IL-6,酶切鉴定,PCR分析,重组质粒测序,结果显示重组质粒与GenBanK中登录的IL-6基因相似性高达98%。将重组质粒pMD-H和pMD-IL-6同时酶切后,构建重组表达质粒pMD-H-IL-6,酶切鉴定,PCR分析,重组质粒测序分析结果为1758bp,将重组质粒转化进宿主菌,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot等分析检测,结果表明CDV H基因可以高效表达,最终表达目的蛋白分子量约为69.5KD。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

【参考文献】
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