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《吉林农业大学》 2017年
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碱茅过氧化氢酶基因对紫花苜蓿遗传转化的研究

王嘉莹  
【摘要】:土壤盐渍化是农业生产中的一个重要的非生物胁迫因素,如何提高作物的耐盐性已经成为作物遗传育种领域的重要研究课题之一。紫花苜蓿是一种被誉为“牧草之王”的多年生优良豆科牧草,在生态环境治理、固土护坡、防止水土流失等方面具有非常重要的作用。如何进一步提高其抗逆性和产量,扩大其种植规模,是当前紫花苜蓿研究领域的重点。目前,基因工程的发展和应用为紫花苜蓿抗逆遗传育种开辟了一条新的途径。吉林省农业科学院牧草生物技术育种研究室前期利用同源克隆结合RT-PCR的方法在吉农朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)中分离到一个过氧化氢酶基因,命名为:PuCAT,并构建了其p3300-35s-PuCAT-NOS植物表达载体。本研究以“公农5号”紫花苜蓿作为受体材料,首先对已有的紫花苜蓿遗传转化系统进行了优化,接着利用农杆菌介导法将上述PuCAT基因转入紫花苜蓿,以期培育出抗盐碱转基因紫花苜蓿新种质。1.试验选择培育7d的无菌苗子叶作为外植体,选用UM+2,4-D 2 mg·L-1+KT 0.25mg·L-1作为愈伤培养基,后将培育出的愈伤组织在不同配比的分化培养基进行分化分析,结果发现,最佳的诱导分化培养基为UM+KT 1.5 mg·L-1。2.试验选择草铵膦作为筛选剂,对愈伤组织而言,其最佳筛选压浓度为2.0 mg·L-1。3.试验通过观察和统计发现,将培养7d的“公农5号”紫花苜蓿无菌苗的子叶在进行农杆菌浸染之前,先预培养2d能够有效增加细胞代谢能力,可促进农杆菌转化。4.经过预培养后的外植体最佳农杆菌浸染菌液浓度为OD600≈0.8,最佳浸染时间为10min。5.外植体与农杆菌最佳共培养时间为3d,此时农杆菌浸染最有效。6.共培养后将紫花苜蓿子叶放到头孢霉素浓度为500 mg·L-1的UM+2,4-D 2mg·L-1+KT 0.25 mg·L-1的培养基中,诱导出的抗性愈伤组织转接到UM+KT 1.5mg·L-1的培养基上进行愈伤分化诱导后,在MS培养基上使其生根成苗,之后将培育成苗的紫花苜蓿进行炼苗,移栽到室外培养。7.将炼苗后移栽成活的紫花苜蓿转基因植株提取DNA后,对其进行目的基因PuCAT和标记基因bar的双重PCR检测。结果表明,目的基因PuCAT和标记基因bar已经整合到“公农5号”紫花苜蓿基因组中。56棵苜蓿分化苗中经筛选获得30棵转基因苜蓿植株。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S541.9

【参考文献】
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