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《吉林农业大学》 2018年
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维氏气单胞菌胞外产物蛋白分析及hisJ基因功能的初步研究

张海朋  
【摘要】:维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种人-兽-水生动物共患病原菌,具有广泛的致病性,鱼类感染A.veronii后常表现出溃疡和败血症,严重可引起死亡,同时人感染A.veronii也会产生腹泻和胃肠炎等症状。胞外产物(Extracellular products,ECPs)是细菌在生长、繁殖过程中不断向外环境释放的代谢产物,它们可以入侵宿主机体,并在宿主体内繁殖扩散,抵抗宿主免疫因子正常工作,进而达到损坏宿主免疫机制,引起宿主发病,严重甚至引发死亡,这些胞外产物主要包括胞外酶、外毒素和肠毒素等,它们对于病原菌的毒力强弱具有重要的作用。近年来,关于A.veronii的报道逐年增多,研究发现,A.veronii具有较强的致病力,但对其致病机理的研究较少。目前国内外研究发现,大多数A.veronii中的胞外产物均可使水生动物感染死亡,但具体是胞外产物中哪种蛋白起到致病作用目前尚不清楚,因此,深入研究A.veronii胞外产物中蛋白质与致病力的关系将为进一步阐明A.veronii致病机制提供依据。本研究成功提取了黄颡鱼源A.veronii TH0426的胞外产物,并通过液相质谱与串联质谱相结合的方法(LC-MSMS)测定其胞外产物蛋白成分,结果表明,黄颡鱼源A.veronii TH0426的胞外产物中含有167种蛋白,此外,本试验以同样的方法提取并测定了其余五种不同源A.veronii胞外产物的蛋白成分,比较发现,AV161(乌鳢源)胞外产物中含有118种蛋白;CVCC3700(狐狸源)胞外产物中含有395种蛋白;ATCC35624(人源)胞外产物中含有189种蛋白;QXF0711B(青虾源)胞外产物中含有90种蛋白;CC-8155(草鱼源)胞外产物中含有197种蛋白。另外,将五种不同源A.veronii的胞外产物与黄颡鱼源TH0426进行比较发现,六种菌共有的蛋白为周质结合蛋白,编码基因为hisJ。在对A.veronii TH0426胞外产物的分泌蛋白进行GO分析发现,其分泌蛋白可参与872个生物学过程,差异显著的有150个(P0.05),主要参与氨基酸分解和生物合成过程,参与454个分子功能,差异显著的有92个(P0.05),主要包括转运蛋白、催化蛋白和周知结合蛋白等。为了探究hisJ基因的功能,本试验通过同源重组的方法利用pRE112自杀性质粒成功构建了缺失株△hisJ,并以pBBR1-MCS、pACYC-184两种表达质粒分别成功构建了互补株C-hisJ(pACYC)和C-hisJ(pBBR),经PCR检测发现,三株菌均可稳定遗传40代以上。此外,本试验通过qRT-PCR发现,互补株C-hisJ(pBBR)中hisJ基因表达量高于互补株C-hisJ(pACYC),因此本试验在生物学特性分析中,我们选择互补株C-hisJ(pBBR)进行后续试验。生物学特性分析结果显示,hisJ基因缺失后,细菌生长形态、溶血活性和游动能力无明显变化,但缺失株细菌的泳动能力和生物被膜形成能力明显减弱,通过鞭毛染色和透射电镜观察发现,缺失hisJ基因后,鞭毛极易脱落。此外,与野生株相比,缺失株对EPC的黏附能力下降了10倍,对EPC细胞的毒力也明显减弱,经动物回归感染斑马鱼和小鼠的致病试验发现,缺失株中斑马鱼的LD_(50)升高了865倍,差异极显著(p0.001),毒力下降,小鼠的LD_(50)也升高了2.8倍,毒力下降,表明缺失株对斑马鱼和小鼠的致病力均显著减弱。在人工感染鲫鱼后计算各组织细菌含量的试验中,与野生株TH0426组相比,缺失hisJ基因后,鲫鱼心、肝、脾、肾细菌含量明显降低,致病力明显减弱。综上所述,本试验通过LC-MSMS的方法分析了六种不同源A.veronii胞外产物中蛋白的种类,在以黄颡鱼源A.veronii TH0426的胞外产物中蛋白为对照发现,六种不同源A.veronii的胞外产物中共有蛋白仅1种,其编码基因为hisJ,通过对A.veronii TH0426株hisJ基因的缺失株和互补株进行生物学特性分析发现,缺失hisJ基因后,A.veronii TH0426的鞭毛极易脱落,生物被膜形成能力和动物的致病力明显减弱,本试验结果为阐明A.veronii的致病机制提供了依据。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.61;S941.42

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