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《吉林农业大学》 2018年
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羊传染性脓疱敦化株基因序列的分析及PCR的检测

李姜  
【摘要】:羊传染性脓疱(CE)是由羊传染性脓疱病毒引发山羊、绵羊等中小型反刍动物的一种急性和接触性传染病。CEV感染动物后与绵羊痘病毒、山羊痘病毒、口蹄疫病毒的发病症状非常相似。目前,CEV采用的检测方法灵敏度和准确率低,为了能够快速高效、准确无误的诊断该病,本研究建立了特异性强、灵敏度高的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。试验一,借助体外培养的MDBK细胞从敦化的患病羊痂皮中分离得到CEV敦化株,对分离株进行了培养特性研究、电镜观察、乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、耐酸性试验、耐碱性试验、耐热性试验、紫外照射试验、动物回归试验,经鉴定该分离毒株为羊传染性脓疱病毒。试验二,将分离出的CEV敦化株的F1L基因序列与国内外发表的不同毒株相应的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示:分离毒株与已发表的毒株的同源性在97%~99%之间,分离毒株与Jilin株的亲缘关系最近,与OV/Torino株的亲缘关系最远,这表明了F1L基因在遗传上高度保守的同时仍然存在一些变异。试验三,根据Genbank已经发表的CEV参考毒株IL-10-LIKE PROTEIN基因序列设计合成一对特异性荧光引物,构建重组质粒作为标准品模板,进行染料法PCR扩增,绘制标准曲线,评价标准品的相关系数,进行重复性和特异性检验,对14例疑似羊传染性脓疱病的临床病料进行检测,验证所建方法的实用性。结果显示:新建立的检测方法最低检测浓度达到了82.9 copies/μL,熔解曲线具有单特异峰,为特异性扩增,重复性好、特异性和灵敏性强、试验稳定,与绵羊痘疫苗、山羊痘疫苗、口蹄疫疫苗不发生交叉反应,14份临床疑似羊传染性脓疱病的病料阳性检出率为100%,说明本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有实用性。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.65

【参考文献】
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【二级参考文献】
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