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《吉林农业大学》 2018年
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PRRSV荧光定量PCR检测方法的建立及净化措施分析

裴儒羿  
【摘要】:猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)能够引起猪繁殖和呼吸障碍综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),是一种在20世纪80年代末发现的具有高度的传染性,能够引起使母猪出现繁殖障碍及仔猪出现严重呼吸道问题的一种疾病。1987年该病初次爆发于美国南部各州,随后该病在全世界大多数国家流行。我国内地在1996年首次报道了PRRS并分离到了PRRSV,随后PRRS在我国进行广泛传播。2006年,在我国第一次爆发高致病性蓝耳病,该病以高热、多发病率和多死亡率为特性,给我国的养猪业造成了很大的打击。目前为止,在中国养殖场场中存在的PRRSV主要是经典型PRRSV,高致病性PRRSV和两者的疫苗株。这几种毒株的存在给国内的养殖场中PRRSV的防控和净化带来了很大的困难。Nsp4由204个氨基酸构成,分子量约为21kDa,是一个非常重要的蛋白酶,具有双重酶活性。Nsp4是所有动脉炎的病毒和冠状病毒都编码的一种3C样蛋白酶(3C-like proteinase,3CLpro)。为了帮助单一猪场进行PRRSV的检测和净化,本研究首先通过对猪场病料的分析,使用对比的Nsp4引物进行扩增,将扩增的nsp4基因片段克隆于pMD-18T载体中,使用DNAStar软件对测序结果进行分析,参照我国国内已发现及分离的PRRSV病毒株的nsp4基因序列进行对比,经过核酸序列分析后发现,猪场内流行毒株和国内HuN4毒株基因序列的相似程度较高。经过进化树分析,分析表明猪场毒株和HuN4毒株相似,将测序序列和HuN4毒株的nsp4序列进行氨基酸比对,发现有测序序列有个别位点突变。要方便快速的检测猪场的PRRSV,本研究针对猪场流行毒株和HuN4毒株的nsp4进行比对,设计出针对PRRSV nsp4核苷酸序列的特异性引物,SYBR Green I建立了可以快速进行PRRSV检测的荧光定量PCR检测方法,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料,在游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,与双链DNA结合后,将会大大增强荧光信号。该方法在检测10~(10)~10~4拷贝/μL,最低能够检测10拷贝/μL的模板,而且特异性比较强,按照荧光定量PCR反应体系同时对猪瘟(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行扩增,结果均为阴性。反复试验发现结果比较稳定,表明建立的方法具有稳定、特异和敏感等优点。对猪场待检测样品进行检测,阳性率高达100%。准确性能够达到预期结果。检测所需要的样品量较少,可以满足猪场对PRRSV的诊断需要。结合建立的检测方法,通过对国内外的动物疫病净化措施等进行总结和分析,根据猪场的自身条件,给予最大的将PRRSV净化的策略。通过对猪场猪舍的分布、猪场的管理、环境的清洁、引种的选择和疫苗的免疫等给予建议,实现猪场内PRRSV净化的目标。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.651

【参考文献】
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