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《吉林农业大学》 2018年
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维氏气单胞菌OmpW基因重组干酪乳杆菌初步应用

李振兴  
【摘要】:维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,AV)是近年来发现的一种可引起人及多种水生生物发病的人-兽-鱼共患的病原菌,广泛存在于自然界水域、土壤和水生动物体中。外膜蛋白W(OmpW)作为维氏气单胞菌的黏附素,是一种潜在的保护性抗原,可以作为基因工程疫苗候选抗原进行试验。乳酸菌是一种公认的益生菌,能够耐受机体的防御机制,通过口服方式,进入机体内可大量存活,并且与肠道粘膜紧密相连,起到调节肠内菌群平衡、增强机体免疫力等益生功能。因此,研制以干酪乳杆菌作为维氏气单胞菌疫苗抗原呈递的载体有非常重要的意义。本研究将预防兽医学研究室保存的维氏气单胞菌OmpW基因重组干酪乳杆菌分泌表达型Lc-pPG612-OmpW和细胞表面表达型Lc-MCS-OmpW进行验证,通过PCR、双酶切和Western blotting验证OmpW基因在乳杆菌中的表达情况。结果显示,经PCR扩增出约600 bp的OmpW基因片段,两种重组乳杆菌表达的约22 kDa的蛋白均具有良好的反应原性。为检验构建的重组菌是否能诱导黏膜和系统免疫应答,本试验以鲫鱼作为试验动物进行免疫学试验。将Lc-pPG612-OmpW和Lc-MCS-OmpW重组菌经乳糖诱导后混合海藻酸钠包被颗粒饵料投喂鲫鱼,在免疫前0天,免疫后7、16、25和34天采集组织和血液,检测组织及血清中相关免疫指标的变化;检测重组乳杆菌在鲫鱼肠道定植情况,单独设定实验组,连续投喂7天,空腹28天后无菌采集前、中和后肠,利用抗性平板进行计数;攻毒试验检测免疫保护率。采用ELISA方法检测血清样品中IgM抗体水平、ACP、AKP、SOD、LZM、IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ指标活性。结果表明,各项指标经过口服免疫后都有明显的提升,通过口服的方式免疫鲫鱼能够诱导鲫鱼体液免疫分泌IgM和多种免疫指标;同时白细胞吞噬活性与分化的能力都明显加强;利用qRT-PCR检测各组织中IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ各细胞因子的转录水平,结果表明:重组乳杆菌通过在肠道的定植刺激黏膜,使细胞因子的转录水平呈上升的趋势,从而提升鲫鱼机体免疫力,定植情况也表明经过28天的空腹,肠道内仍存在重组乳杆菌,表明其在机体内的定植能力良好;攻毒后观察20天,发现重组乳杆菌能有效的缓解维氏气单胞菌造成的急性感染,在一定程度上起到保护作用。综上所述,本试验对研究室保存的维氏气单胞菌OmpW基因重组干酪乳杆菌Lc-pPG612-OmpW和Lc-MCS-OmpW进行验证,经过口服的方式免疫鲫鱼后可诱导机体产生体液免疫应答,产生高水平IgM和上调免疫相关酶的活性,同时促进白细胞分化和加强其吞噬活性,提高了机体的体液免疫应答,各组织细胞因子的转录水平也呈上调的趋势,重组乳杆菌能有效的保护鲫鱼并提高其机体的免疫力,研究结果为水产载体疫苗和口服乳酸菌疫苗的研制及应用提供了依据。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S941.42;S852.61

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