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《吉林农业大学》 2004年
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羊草遗传转化受体系统的建立及转BADH基因的研究

曲同宝  
【摘要】:羊草(Leymus chinensis/Aneurolepidium chinensis)是分布于我国北方天然草地面积较广、营养价值较高而且较耐盐碱的优良的禾本科牧草,是经济价值较高的草原类型。羊草具有耐寒、耐旱、耐湿、耐践踏、耐土壤瘠薄和一定的耐盐碱能力,适应范围很广。但是由于近年来人们的过度开发和利用,造成天然羊草草原的退化。为了保护羊草资源,提高草地生产力,探索改良盐碱化草地的技术和途径已成为必然趋势,如何利用大面积盐碱地是我们全人类迫切需要解决的问题。 羊草是建立人工草地和治理盐碱化草地的理想草种,虽具有一定的抗盐碱能力,但一直未能很好地发挥改良盐碱地的作用。根据羊草生育规律及生物学特性,进行栽培、利用,充分发挥羊草具有的耐盐碱能力,不断培育出高度耐盐碱的羊草新品种,才是开发利用羊草草地资源的根本对策。 采用传统的育种方法选育耐盐品种极为缓慢。随着分子生物学技术的发展,人们可以用基因工程技术提高植物的耐盐碱性。提高植物抗盐性最根本、最经济、最有效的方法是充分利用抗盐基因,培育新的高抗盐品种。 本文利用野生羊草种子采用组织培养方法,探索羊草的生长发育规律及相关的生物学特性,开展羊草组织培养和遗传转化研究,建立了高效的羊草遗传转化受体系统,为培育出品质优良又高度抗盐碱的羊草新品种打下良好基础;并在此基础上,进行了羊草愈伤组织的抗旱、抗盐碱敏感性研究,确定羊草愈伤组织在盐碱培养基上的最大忍受强度,通过在高盐碱浓度培养基上筛选,希望获得羊草耐盐突变体植株;首次通过基因枪方法将BADH基因转入羊草受体系统中,并对转化结果进行了初步检测。取得的主要研究结果如下: 一、建立并优化了羊草遗传转化受体系统 1.羊草愈伤组织的获得 羊草的成熟胚(种子)及根茎是诱导愈伤组织理想外植体。外植体的灭菌时,首先用70%乙醇浸泡5min,然后在1g/L升汞溶液中浸泡15min,这样可以达到灭菌的最佳效果。羊草种子具有休眠特性,经过低温处理后有利于种子萌发,随着低温处理天数增加,种子萌发率也升高;变温更有利于羊草种子萌发。用100ppm赤霉素(GA_3)处理休眠的羊草种子时,处理48小时为打破休眠、促进萌发的最佳时间,种子的萌发率可达16%。 为了提高成熟胚的胚性愈伤组织的诱导率,设计了不同的培养基及不同的激素浓度。羊草愈伤组织诱导采用MB(MS+B5有机)培养基,当培养基中2,4-D的浓度 吉林农业大学硕士学位论文 羊草遗传转化受体系统的建立及转BADH基因的研究 为2 .Omg/L时诱导率为20%,本实验中,羊草愈伤组织诱导的最适2,4一D浓度为 2.smg/L,诱导率达到了24%。 2.羊草愈伤组织的继代培养 羊草愈伤组织继代培养的最佳2,4一D浓度为2 .omg/L .MB和Ms培养基是较 适宜的羊草愈伤组织继代培养基。在继代培养中蔗糖较适宜的浓度为409/1。培养 基中脯氛酸浓度为2 50omg/L,是羊草愈伤组织的生长以及胚性状态保持较适宜的 浓度。 3.羊草愈伤组织的分化及再生 羊草再生系统属于胚胎发生型,随继代培养时间的延长,愈伤组织的分化能力 将迅速下降,继代培养6个月后分化能力基本丧失,所以用于分化的羊草愈伤组织 继代时间不宜过长。 培养基中加入0 .smg/L6一BA为羊草愈伤组织分化最佳条件,分化率达到了 2 6 .67%。生根培养基中加入NAA的最适宜浓度为2 .omg/L。如果在愈伤组织分化前 进行预分化10一30天,可以明显提供分化出苗率。 二、羊草愈伤组织耐盐敏感性测定 综合增重指数和愈伤组织生长状态两种因素考虑,羊草愈伤组织对中性盐 (Nael)的可耐受最大强度为1 50二01/L,对碱性盐(NaHeo。与NaZeo。)的可耐受 最大强度为4Inmol/L,对PH值的可耐受最大强度为8 .0。羊草愈伤组织在高盐浓度 条件下,可以筛选出耐盐突变体植株。从4Inmol/L开始筛选,通过逐步提高碱性盐 浓度的方法,最终获得了碱性盐筛选浓度为12~1/L耐盐植株的愈伤组织,并成 功分化出5株幼苗。经形态学观察发现其叶色浓绿,株型低矮,茎叶直立,与一般 分化植株明显不同。 三、基因枪转化参数研究。 当培养基中的kana功yC in浓度达到140啊/L以上时,羊草愈伤组织增重指数明 显下降,达到1 50mg几时,羊草愈伤组织已经基本停止生长,羊草愈伤组织对卡 那霉素的敏感浓度为1 50mg/L。羊草遗传转化可能不适宜用农杆菌浸染法。 本实验中用于基因枪转化的杭盐碱基因为甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因。PCR 及电泳结果表明,BADH基因已被整合到羊草染色体组中。采用基因枪转化研究, 不同的轰击距离(6cln、gcm、12Cm)转化效率不同。随着轰击距离的加大,转化效 率逐渐降低,当距离为6cm时,枪击后细胞受损严重,褐化较多,因此9 Cm轰击 距离较为适宜。DNA用量为每枪6ul(含3。。ug金粉和1 .ZugDNA),11oopsix 吉林农业大学硕士学位论文 羊草遗传转化受体系统的建立及转BADH基因的研究 9。。的压力x靶距组合,转化效果最好。在轰击距离为gctn的条件下,轰击1、 2、3次,转化效率分别为88 .13%,41 .12%和18 .21%,轰击1次时转化效果最好。 植物转化研究中,高效遗传转化受体系统的建立是转
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S54

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
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【共引文献】
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10 徐丽;张胜利;张建;陈颖;王兴智;朱筱娟;梁秀梅;;番茄抗黄瓜花叶病毒病基因转移的研究[A];蔬菜分子育种研讨会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 霍秀文;冰草组织培养再生体系建立及耐旱转基因研究[D];内蒙古农业大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【相似文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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5 刘公社;徐夙侠;刘志鹏;舒庆艳;;羊草种质资源遗传多样性的形态和AFLP分子标记评价[A];中国草学会牧草育种专业委员会2007年学术研讨会论文集[C];2007年
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7 杨凤和;成文革;;浅谈羊草的饲料特性和产业化前景[A];草业与西部大开发——草业与西部大开发学术研讨会暨中国草原学会2000年学术年会论文集[C];2000年
8 卢小良;蒲英远;梁柱;周托方;陈昌建;;东北大安羊草干草饲喂奶牛的试验[A];全国半农半牧区草地农业可持续发展研讨会文集[C];2000年
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10 孙娟娟;玉柱;那日苏;吴亚伟;薛艳林;白春生;;乳酸菌制剂及纤维素酶对羊草青贮品质的影响[A];农区草业论坛论文集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
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2 记者 达娃·梅朵;羊草山家家通了水泥路[N];昆明日报;2007年
3 本报记者 张兆军;小草蕴藏大市场[N];科技日报;2000年
4 通讯员 石明山 李宏 记者 张兆军;羊草移栽“抹绿”盐碱地[N];科技日报;2005年
5 武保国;适于北方播种的优质牧草——羊草[N];中国畜牧兽医报;2008年
6 记者 张兆军;吉林省羊草工程中心成立[N];科技日报;2000年
7 付义书 本报记者 苑海志;安全第一 生产第二[N];吉林日报;2006年
8 郭建军 卢书友;中国恢复向中东出口活羊[N];中国贸易报;2004年
9 吉林省生物研究所;耐盐碱的优良牧草——吉生羊草[N];山西科技报;2001年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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3 侯建华;羊草与灰色赖草杂交后代遗传学特性及育性恢复的研究[D];内蒙古农业大学;2004年
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5 李振侠;苹果砧木耐盐突变体的筛选及其鉴定[D];河北农业大学;2006年
6 李新玲;羊草乙醛脱氢酶基因的克隆及CBF2转录因子功能的研究[D];东北林业大学;2007年
7 解莉楠;盐碱胁迫下羊草相关基因及蛋白质的表达谱研究[D];东北林业大学;2007年
8 刘惠芬;内蒙古中东部草原羊草(Leymus chinensis)种群分化的生态遗传分析[D];南开大学;2004年
9 许振柱;半干旱区典型植物对气候变化与CO_2浓度升高的响应与适应[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2003年
10 刘艾;三江平原沼泽化草甸综合治理技术研究[D];内蒙古农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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2 张玉芬;羊草种内变异与分化的研究[D];东北师范大学;2002年
3 汪恩华;羊草繁殖生物学特性的研究[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2002年
4 姜述君;羊草(Aneurolepidium Chinense (Trin) Kitag)耐盐碱生理生态特性研究[D];东北农业大学;2002年
5 胡勇军;植物生长调节剂对羊草人工草地产量及其品质影响的研究[D];东北师范大学;2004年
6 黄泽豪;羊草(Leymus chinensis)生殖生态学的研究[D];福建师范大学;2003年
7 崔爽 ;外源赤霉素(GA_3)对羊草生长发育及生物量的影响[D];东北师范大学;2004年
8 胡国富;用微卫星及ISSR法对羊草(Aneurolepidium Chinense (Trin) Kitag)遗传多样性的研究[D];东北农业大学;2002年
9 杜娟;羊草种群对放牧的表型可塑性研究[D];东北师范大学;2004年
10 李静;盐碱胁迫及施加植物生长调节剂对羊草克隆可塑性影响的研究[D];吉林大学;2004年
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