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《吉林农业大学》 2004年
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人参皂苷微生物转化的研究

付建国  
【摘要】:现代医学和药理学研究证明,人参皂苷为西洋参的主要有效成分之一,它具有西洋参根的主要生理活性。迄今为止,分离并确定了结构的单体皂苷成分有50余种。人参各单体皂苷普遍具有调节免疫系统、降低血清中胆固醇的含量、防治心血管疾病、消炎、解毒等生理功效。目前,由于人参皂苷尚未实现全化学合成,其单体皂苷临床应用只能从人参、西洋参的根、茎、叶及果等部位提取总皂苷后,经加工(物理、化学和酶解等)、分离及纯化,以满足医疗需要,为了获得具有极高药用价值的人参稀有皂苷(如Rh_2、Rg_3等),国内外化学、药学及生物技术工程研究人员积极探索人参皂苷的结构改造工程,其研究目标主要锁定在对人参二醇系皂苷C_3和C_(20)位的糖基结构修饰,利用不同方法对人参皂苷糖基进行结构改造,使人参、西洋参中含量较高的二醇系人参皂苷Ra、Rb、Rc、Rd等的糖基经过水解作用,定向转化为稀有人参皂苷如Rh_2、Rg_3等。目前,主要应用的方法有酶水解法改变人参皂苷结构。我国学者在人参皂苷结构改造工程方面取得了突破性进展,大连轻工业学院金凤燮教授发明的“酶转化法生产Rh_2等人参稀有皂苷”,在2003年度国家科学技术奖励大会上,获得国家技术发明二等奖。 在以往的研究中,生物体系选择上,主要以低等微生物为主,在底物选择方面,则以人参二醇系皂苷为首选;而获得的目的产物则主要为Rh_2,酶转化法为主要采取的人参皂苷转化法。 本研究采用不同于以往的策略,对人参皂苷进行微生物转化,(1)底物:为西洋参及其根部提取物,取材容易,不用作前处理。(2)转化用微生物:高等大型药食两用菌,其优点为:a菌种明确;b来源广泛,且便于菌株筛选(或菌株改造);c不产生有毒物质。(3)共培养亦即将底物与微生物一起培养,而不单纯用酶催化。目前这一方法已经成为目标化合物转化合成与活性化合物结构优化的首选方法。(4)目标产物为新型西洋参--菌参。 通过对不同时期产物中人参皂苷含量的测定,结果显示(1)人参二醇系皂苷Rb1在发酵前期转化为Rd,在发酵后期Rd则被大量分解,而Rb1含量基本不变。(2)在发酵过程中,产生的新的化合物Compound K,第5d和第10d发酵产物中基本相同。(3)二醇系皂苷Rb_2、Rc以及三醇系皂苷Re、Rg_1其含量变化不显著,(4)发酵产物中未能检测到Rh_2、Rg_3及人参二醇、三醇系皂苷。到目前为止,无论是采用酶法制备稀有人参皂苷抑或液体摇瓶发酵法转化人参皂苷,关注的仅是产物中稀有皂苷的种类及其含量,而未见有转化过程中二醇系皂苷和三醇系皂苷含量变化的报道。因此,转化反应机理的探讨均带有一定的主观性,本研究通过不同的发酵方法,在不同时期对二醇系皂苷和三醇系皂苷含量的变化及新成分的产生,首次客观地推断出人参二醇系皂苷Rb_1在微生物发酵条件下的转化途径:即GRb_1→GRd→ 吉林农业大学博士学位论文人参皂普微生物转化的研究 GComPoundK。 人参皂普代谢产物的药理作用研究表明,口服人参皂普的抗肿瘤活性是肠内厌氧菌代谢 产物所致。CK是被吸收到血液中的主要代谢产物,CK在体内和体外均有杭肿瘤细胞活性。人 参皂普C ompoundK过去只是在人们研究人参皂普的生物代谢过程中被发现,即人参皂普经生 物转化,在土壤细菌类的水解、真菌、特殊酶的水解或口服人参后在动物的肠内菌代谢作用 下,才能产生。ComPoundK的特别性在于其结构的特点。此化合物为原人参二醇系皂普,是 原人参二醇型皂普元(非糖部分)与糖结合在CZ。位的羚基上。C3和CZ。位结合糖的稳定性, 由于所处的空间化学环境不同,前者大于后者,也就是说,当皂普元C3和CZ。位都结合糖, 如果进行部分水解(化合法的弱水解),那么,CZ。位结合的糖首先水解下来,而C3位结合的 糖不受影响。这就意味着此化合物的形成(合成或降解)只有在特定的条件下(如特殊酶, 有人认为需要在无氧条件下)才能发生。本研究采用的菌株能特异性水解C3位目一D一葡萄糖普 键的菌株,从而产生CompoundK,不仅为日后分析酶的结构和功能,从分子生物学水平研究 探讨人参皂普C ompoundK产生的机理莫定了基础,而且也为大量生产人参皂普CompoundK 提供了有力的技术支持。 本项研究的创新之处是: .首次建立了西洋参固态发酵的实验室反应体系。利用该方法研究人参皂普在微生物作 用下的分解合成代谢,为将来通过微生物发酵工程,实现人工调控获得目的产物提供了理论 依据和应用前景。 .技术路线设计独特。本研究采用不同于现有的菌种改良技术,筛选产生专一性酶的菌 株获得目标产物,为人参皂普结构改造工程筛选效率更高,专一性更强的产酶微生物提供了 方法学上的借鉴; .具有重要的理论意义和应用价值。如何实现中药现代化是当前中医药研究的难点和热 点,本项目采用具有水解C3位上p一D一葡萄糖普健的菌株,西洋参为营养基质,固体发酵进行 人参皂普的结构改造,这在国内外尚属首次,西洋参作为“药性基质”,由特定药用真菌发酵, 将会产生一系列复杂的生理活动和生化效应,产生新的活性成分和新的功能。因此,具有活 性成分的药性基质被药用真菌发酵,它既能提供真菌所需营养大量产生菌
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