大豆细胞质雄性不育系与保持系线粒体DNA的RAPD分子标记

【摘要】：随着分子生物学的发展,有关细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)机理的研究取得了大量进展。在玉米、矮牵牛、水稻、小麦、油菜、向日葵和菜豆等不育胞质的线粒体基因组上已找到了可能与CMS有关的基因座位。同其它作物相比,大豆CMS的研究进展缓慢。自1993年吉林省农科院孙寰等发现世界上第一个大豆细胞质雄性不育系以来,该领域的研究和应用取得了可喜的进展,但是对其分子机理的研究报道尚属空白。 本实验以栽培大豆的三对不育系和保持系材料(JLCMS1-1A、JLCMS1-1B、JLCMS1-2A、JLCMS1-2B、JLCMS1-3A、JLCMS1-3B)为研究对象(成对材料间为严格的同核异质材料),通过随机扩增多态DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD)技术,对大豆不育系与保持系线粒体基因组进行扩增,旨在探讨大豆不育系与保持系线粒体基因组间的差异,为大豆细胞质雄性不育相关基因的分离鉴定打下基础,并为揭示大豆细胞质雄性不育(CMS)的分子机制提供理论依据。 对大豆线粒体基因组进行RAPD分析,模板DNA的质量要高,即不能含有蛋白质或核DNA等的污染。参考其它作物线粒体DNA的提取方法,经改进后,所提取的大豆线粒体DNA样品经琼脂糖凝胶电泳分析、OD值测定,结果表明其得率和纯度可以满足PCR扩增;酶切分析和线粒体特异引物的扩增结果显示,线粒体DNA不含有核DNA的污染。 本研究首先建立了稳定、高效的RAPD反应体系,然后利用OPERON公司的400个随机单引物(OPA-OPT系列)和14组双引物对供试材料进行扩增,大部分引物均有清晰稳定的扩增产物。RAPD反应体系具体参数如下:dNTPs浓度为0.1mmol/L;Taq酶用量为2U;模板DNA浓度为0.4ng/μL;引物浓度为0.8ng/μL。 RAPD分析中,有些特异带只出现在不育系上,而在保持系相应的位置上没有。如引物OPE01、OPH07、OPI12、OPK04、OPP17、OPN03、OPD02和OPD20仅在不育系上出现特异带。植物的线粒体基因组容易因DNA片段的插入、缺失或重组而引起控制花粉可育功能的基因发生突变,从而使育性发生改变。这些特异扩增的片段只出现在不育系上,说明不育系的线粒体基因组可能比保持系的线粒体基因组多出某段序列或发生了基因重组而引起基因组织结构的改变,并最终引起大豆细胞质雄性不育。 相反,有16个引物(OPA12、OPB06、OPD11、OPD18、OPH18、OPI06、OPI09、OPK07、OPL05、OPL10、OPL13、OPM06、OPP09、OPP15、OPQ13、OPR03)仅在保持系上获得了一条或多条特异扩增片段,说明不育系的线粒体基因组比保持系的线粒体基因组缺少某段序列使差异产生。这种仅出现在保持系上的特异片段在数量上要多于出现在不育系上的