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《吉林农业大学》 2005年
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玉米淀粉分支酶SBEⅡb基因启动子的克隆与功能分析

徐亚维  
【摘要】:目前,基因工程中存在的主要问题是外源基因的表达水平、表达部位等问题,因此,作为调控基因表达关键元件之一的启动子的研究便成为基因工程研究的关键。启动子有组成型启动子(constitutive promoter)、组织特异性启动子(tissue-specific promoter)和诱导型启动子(inducible promoter)三种。迄今为止,植物表达载体中应用最广泛的是CaMV 35S组成型启动子,它导致外源基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达,不但造成能源的浪费还会引起植物的形态发生改变,影响植物的生长发育。这就使人们越发注重特异表达启动子的研究和应用,使启动子在特定的组织和一定的发育时期启动基因表达,既保证了外源基因在植物体内的有效发挥又减少了对植物的不良影响。虽然已有许多特异启动子被相继克隆成功,但是较理想的、真正能应用于生产实践的组织特异性启动子并不多,种子特异性启动子更少。本文克隆的玉米淀粉分支酶sbe Ⅱb基因启动子是种子特异启动子。玉米淀粉分支酶(SBE)是玉米淀粉合成过程中的关键调控酶之一,有sbe Ⅰ、sbe Ⅱa和sbe Ⅱb三种同工酶,其中sbe Ⅱb对胚乳直链淀粉含量的影响最大。因此,提高sbe Ⅱb的表达水平就成为当今植物基因工程中的研究热点。目前,只检索到关于大麦sbe Ⅱb基因启动子的研究,对于玉米sbe Ⅱb启动子研究的报导未见发表。此论文旨在用组织特异性启动子sbe Ⅱb去代替CaMV 35S组成型启动子,构建新的植物表达载体,启动玉米淀粉分支酶基因在植物体内的特异表达,为提高玉米淀粉中直链淀粉的含量及改变玉米淀粉品质奠定基础。 本研究分别以普通玉米及黄、白粘玉米的基因组DNA为模板,根据已知玉米sbe Ⅱb基因启动子序列(GenBank:AF072725),设计一对引物,通过LA-PCR扩增出sbe Ⅱb基因启动子的部分片段。因为黄粘玉米“吉糯1号”的目的片段较特异,所以取其基因组DNA的PCR产物作为进一步实验的材料,再将此片段插入pMD18-T Vector克隆载体获得重组质粒。重组质粒经大肠杆菌转化后进行蓝白斑筛选,得到17个白斑,32个蓝斑。提取阳性菌落的质粒进行PCR检测和酶切鉴定,结果所得片段大小和目的片段一致。鉴定后的菌株送交大连宝生物公司测序并利用DNAMAN生物软件进行分析。结果表明所克隆的插入片段长为934bp,与预期设计的大小一致,仅有14个碱基发生突变,同源性达到98.52%。序列中发现高等植物启动子所特有的基本核心序列TATA-box(TATAATA)和CAAT-box。作为真核启动子基本调控元件的GC盒竟有6个拷贝。此外,序列中出现了许多种子特异表达所须的特殊调控元件,如在-865bp处出现的胚乳表达顺式作用元件GCN4(TGAGTTTC);在-113bp处的种子特异作用因子RY-element(CATGCA);
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S513

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