耐盐基因胆碱单加氧酶基因和甜菜碱醛脱氢酶基因转化大豆的研究
【摘要】：大豆是一种重要的油料作物，是植物蛋白及油脂的重要来源，在我国广泛种植，大豆产业在国民经济中占有非常重要的地位。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。在耕地面积有限的情况下，开发利用盐荒地也是国内外研究的热点课题。
土壤盐渍化是降低农作物产量的主要环境因素之一。大豆是对盐分中度敏感的作物、耐盐性差。因此，培育耐盐大豆品种具有重要的意义。但是由于缺乏可用的耐盐育种材料，采用常规的育种技术至今尚未能培育出令人满意的耐盐大豆品种，而且进程缓慢。随着分子生物学技术的发展，通过转基因技术对大豆进行有目的的改良，是一种较常规育种更为有效、快速的方法，是现代生物技术在农业生产实践中的具体应用。
本试验采用吉林省大豆优良品种的子叶节为材料建立受体系统，进行耐盐基因的遗传转化研究，为培育出高度耐盐的大豆新品种打下良好基础；并在此基础上进行了大豆子叶节及转基因大豆幼苗的耐盐性研究，确定了大豆子叶节在含盐培养基上的最大耐受强度和大豆幼苗对盐的最大耐受强度，依此临界浓度对已转化的子叶节及大豆苗进行筛选。同时在同一盐胁迫下，我们对转基因大豆幼苗的生理生化指标进行了检测，并与对照进行了对比，从而鉴定和评价转胆碱单加氧酶基因(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)大豆的耐盐性。取得的主要研究结果如下：
一、大豆遗传转化方法研究
1．农杆菌介导法转化研究
本试验中用于转化的耐盐基因为胆碱单加氧酶基因(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)。以大豆品种吉农13和吉农17的子叶节为材料，通过利用农杆菌介导法将耐盐基因导入大豆中，研究农杆菌转化系统的优化条件，探讨不同的侵染时间、不同的菌液的浓度等条件对转化效果的影响。结果表明，浓度(OD值)在0.5-0.6左右，侵染25min时的子叶节的侵染效果最好，并采用NaCl浓度为200mmol／L的含盐培养基对其进行筛选，同时将转化的子叶节进行分化出苗后进行PCR检测和Southern杂交，证明外源目的基因胆碱单加氧酶基因(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)已分别整合到大豆基因组中。
同时对大豆子叶节的耐盐性进行了研究，在不同盐浓度下观察子叶节生长状态，并计算其成活率，从而确定大豆子叶节对盐水的耐受强度，用此临界浓度对转基因子
【关键词】：大豆 胆碱单加氧酶基因 甜菜碱醛脱氢酶基因 农杆菌介导法 花粉管通道法 【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：S565.1
【目录】：
- 前言11-25
- 第一部分 大豆遗传转化研究25-67
- 1 农杆菌介导法的遗传转化25-61
- 1.1 试验材料25
- 1.1.1 转化受体材料25
- 1.1.2 非转化受体材料25
- 1.2 试剂25
- 1.3 培养基25-26
- 1.4 菌株和质粒26-27
- 1.5 主要仪器设备27
- 1.6 PCR引物27-28
- 1.7 实验方法28-34
- 1.7.1 质粒的提取28-30
- 1.7.2 质粒携带基因的鉴定30-32
- 1.7.3 大肠杆菌感受态的制备和转化32-33
- 1.7.4 转化农杆菌33-34
- 1.8 农杆菌介导的大豆的遗传转化研究方法34-45
- 1.8.1 大豆子叶节选择压的确定34
- 1.8.2 农杆菌工程菌液的制备34-35
- 1.8.3 大豆子叶节培养和处理35
- 1.8.4 大豆子叶节的转化35
- 1.8.5 大豆转基因植株分子生物学检测35-45
- 1.9 结果与分析45-59
- 1.9.1 大豆子叶节抗生素选择压的确定45-49
- 1.9.2 不同大豆品种子叶节NaCl选择压的确定49-52
- 1.9.3 农杆菌转化胆碱单加氧酶基因和甜菜碱醛脱氢酶基因条件的优化52-55
- 1.9.4 抗性大豆子叶节的分化、出苗55
- 1.9.5 T_0代转耐盐基因大豆再生植株的分子生物学检测55-59
- 1.9.6 T_0代转耐盐基因大豆再生植株的NaCl耐盐试验59
- 1.10 讨论59-61
- 2. 大豆花粉管通道的遗传转化61-67
- 2.1 材料与操作方法61-63
- 2.1.1 材料61
- 2.1.2 外源 DNA制备、导入及检测61-63
- 2.2 结果与分析63-66
- 2.2.1 大豆苗期NaCl选择压的确定63-65
- 2.2.2 T_0代转耐盐基因大豆再生植株的分子生物学检测65-66
- 2.2.3 T_0代转耐盐基因大豆再生植株的NaCl耐盐试验66
- 2.3 讨论66-67
- 第二部分 转基因大豆耐盐相关的生理生化指标检测67-77
- 1. 试验材料与方法67-69
- 1.1 供试材料67
- 1.2 试验方法67-69
- 1.2.1 田间T_0代转耐盐基因大豆的生理生化指标测定67
- 1.2.2 转基因大豆耐盐相关的生理生化检测指标与方法67-69
- 2. 结果与分析69-75
- 2.1 成活的转耐盐基因PCR阳性大豆植株统计69
- 2.2 转基因大豆耐盐相关的生理生化检测结果69-75
- 2.2.1 相对电导率的测定69-73
- 2.2.2 大分子渗漏值的测定73-74
- 2.2.3 甜菜碱含量的测定74
- 2.2.4 BADH活性的测定74
- 2.2.5 丙二醛(MDA)含量的测定74
- 2.2.6 脯氨酸的测定74-75
- 3 讨论75-77
- 第三部分 结论77-78
- 附录78-79
- 参考文献79-85
- 图版说明85-93
- 作者简历93-94
- 致谢94
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