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《吉林农业大学》 2007年 博士论文
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大豆凝集素在不同种属动物体内的消化动力学及抗营养作用比较研究

王利民  
【摘要】: 本论文研究了大豆凝集素的提纯、检测和在反刍动物(羊)、肉食动物(狗)、啮齿动物(兔)、杂食动物(猪)和禽类(鸡)等不同种属动物体内的消化动力学及抗营养作用,共包括四个部分。不同种属动物都选取雄性半性成熟年龄。 为获得大量纯品大豆凝集素,采用N-乙酰基-D-半乳糖胺-epoxy-sepharose 6B亲和层析体系和瓜尔胶亲和层析体系提纯了大豆凝集素,并对两种方法进行了多方面的比较和筛选。经鉴定(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和红细胞凝集试验),用两种方法提纯的大豆凝集素纯度和生物活性均与大豆凝集素标准品一致,但两种亲和层析体系纯化大豆凝集素的产率和的亲和饱和度均显著差异(P<0.05)。这一结果表明提纯大豆凝集素较理想的方法是N-乙酰基-D-半乳糖胺-expoxy-sepharose6B亲和层析体系。用提纯的大豆凝集素制备了兔抗大豆凝集素多克隆抗体,并建立了大豆凝集素的间接抑制ELISA定量检测方法,检测下限低于10ng/mL,灵敏可靠,能满足整个研究的需要。 比较研究了大豆凝集素在不同种属动物肠道不同区段食糜中的免疫活性残留规律。日粮中含20%的生大豆,并添加1%的Cr_2O_3作为外源指示剂。经过两周的饲养试验,于最后一次饲喂2 h后麻醉放血,立即取十二指肠、空肠前、空肠中、空肠后、回肠、盲肠、结肠(鸡为结直肠)各肠段内的食糜,—20℃冻存待测。食糜和饲料中的大豆凝集素采用试验一建立的方法检测,食糜和饲料中的总Cr采用原子吸收光谱法检测。结果表明,同一种动物不同肠段内的大豆凝集素残留率不同,总的趋势是由前向后呈下降趋势,各肠段内都能检测到大豆凝集素。其中,由十二指肠到空肠前段的残留率变化在五种动物均最显著(P<0.05)。在不同动物的同一区段肠道内,大豆凝集素的残留率随动物的不同而有差异,兔各肠段中的残留率均最低,十二指肠到空肠后段羊和鸡的残留率相对较高,猪和狗的残留率介于中间。空肠之后,猪、羊和鸡的残留率较高。 在体外模拟胃/肠环境下研究了大豆凝集素的降解规律。将不同浓度(1、2、3、4和5mg/mL)的大豆凝集素分别与等体积的模拟胃液、模拟肠液混合(37℃),于不同时间(15s、30s、60s、2min、4min、8min、15min、30min、60min)终止反应,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和试验一建立的ELISA两种方法检测反应体系中剩余的大豆凝集素。结果显示,胃蛋白酶降解大豆凝集素主要发生在反应的初始阶段,随着反应时间的延长降解速率逐渐变慢,但反应一直在进行;随着大豆凝集素浓度从1mg/mL增加到5mg/mL,其降解速度一直在增加,但彻底降解所需的时间延长,完全降解的时间范围分布在9.5min到23min之间。胰蛋白酶对完整的大豆凝集素不产生降解作用。 用不同浓度(0.5、1.0和3.0 mg/mL)纯化的大豆凝集素对麻醉状态下的上述五种动物进行活体小肠结扎灌注(8h),进一步比较研究了大豆凝集素在不同种属动物空肠内的吸附、吸收和残留之间的相互关系及其对小肠组织结构的影响。结果表明,大豆凝集素在不同种属动物小肠内的吸附、吸收和残留规律不尽相同。兔的吸收率最大,残留率较小;相反,羊的残留率最大,吸收率最小。鸡的情况同兔基本一致,但二者相比兔的残留较少而吸收较多。与兔和鸡相比,猪和狗的吸附能力均较大,而吸收能力较小。各种动物均对较低浓度的大豆凝集素有较强的吸收能力。 本论文的研究表明,大豆凝集素在不同种属动物及其不同肠段内的残留规律不同,所选五种动物由十二指肠到空肠大豆凝集素消失得最快,表明动物对大豆凝集素的吸附、吸收和/或降解主要发生在小肠前部。动物的胃蛋白酶对大豆凝集素有一定程度的降解,但降解需要一定时间。胰蛋白酶对完整的大豆凝集素不产生降解作用。不同种属动物小肠黏膜对大豆凝集素的敏感性和耐受性不同,反刍动物小肠黏膜对大豆凝集素的敏感性较低,单胃动物对大豆凝集素的吸收和吸附能力大于反刍动物。单胃动物中,兔对大豆凝集素吸收能力最强,表明其小肠黏膜对大豆凝集素的通透性最大,更易于引起因吸收大豆凝集素而造成的抗营养作用。鸡与兔的趋势基本一致,不过鸡的小肠黏膜对大豆凝集素的吸收能力不如兔。猪和狗的小肠黏膜对大豆凝集素的吸附较多而吸收较少,说明猪和狗的小肠黏膜对大豆凝集素的特异性结合较强但通透性较弱,更易于引起因大豆凝集素吸附于小肠黏膜表面而造成的抗营养作用。大豆凝集素对不同种属动物的抗营养程度和抗营养机理不尽相同。


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