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《吉林农业大学》 2007年
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牛传染性胸膜肺炎诊断技术与分子流行病学研究

辛九庆  
【摘要】: 牛传染性胸膜肺炎亦被称为牛肺疫(Contagious bovine pleuropneumonia CBPP)是由丝状支原体丝状亚种SC生物型(Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides SC MmmSC)引起的一种亚急性或慢性、接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。该病在20世纪20年代传入我国,危害严重。从20世纪50年代我国开始大面积使用牛传染性胸膜肺炎疫苗,有效地控制了该病在我国的流行。我国虽然于1996年宣布消灭了牛肺疫,但由于没有获得国际认证,国际社会也就不承认我国已消灭牛肺疫。农业部兽医局根据国际动物疫病流行趋势和世界动物卫生组织的相关工作计划,从2002年开始在全国开展牛肺疫的流行病学监测工作,为国际无病认证做技术准备。 在流行病学监测工作中,血清流行病学资料是一个非常重要的方面。目前所应用的OIE推荐的补体结合试验方法(CFT)在基层推广使用面临很大的困难,而我国还没有更好的诊断方法可以与CFT联合应用,建立一种敏感、特异、方便基层应用的血清学诊断方法将对血清流行病学监测工作起到重要作用。在对CBPP血清阳性病例的诊断上,常规病原分离虽然仍是最有效的确认手段,但快速、特异的病原检测PCR方法已经成为一种更加重要的技术手段,建立敏感、特异的PCR方法可以在最短时间内进行病原诊断,为病原分离提供依据。CBPP在我国流行虽有半个世纪之多,但关于该病的分子流行病学资料却是一直是空白。根据记录的流行病学资料,CBPP有可能通过两种途径传入中国,一种是通过我国与俄罗斯边境牛只贸易,另一种是从澳大利亚引进良种牛在上海入境后传入我国。但根据MmmSC基因组和抗原性的不同,可以将其分成欧洲群和非洲-澳大利亚群,而这两个基因群的菌株却表现出不同的致病力和流行病学特征。那么究竟中国流行的MmmSC是归属于那一个基因群,其究竟是从何处传入我国目前并不清楚。 在血清学诊断方法研究方面,由于lppQ基因和其编码的脂蛋白LppQ(LipoproteinLppQ)存在于MmmSC非洲株、欧洲株和疫苗株中,而在丝状支原体簇的其他成员中未发现,没有血清学交叉反应,并且成熟的脂蛋白LppQ N末端是亲水性的,在自然感染和人工感染时,特异性免疫反应产生早,持续时间长,抗体滴度高,因此,LppQN末端基因编码的蛋白是一种较为理想的CBPP诊断抗原。序列分析显示,TGA密码子在支原体中被编码为色氨酸(Trp),而在其他微生物中则为终止密码子。本研究利用一步重叠延伸PCR突变方法体外诱变我国生产抗原用毒株HVRI X的lppQ基因。序列分析表明将第198位的TGA成功突变为TGG,将突变后的脂蛋白LppQ N末端基因插入原核表达载体pET32a的多克隆位点,构建了脂蛋白LppQ N末端基因原核表达载体。表达后蛋白质分子量约为42KD,带有6个His标签,纯化后蛋白质纯度为95%,Western-blot结果显示具有很好的免疫活性。将纯化的蛋白质稀释至0.33μg/ml包被酶标板。经统计学分析后确定了判定标准:即样本S/P大于0.5为阳性,小于0.4为阴性,两者之间为可疑。通过对100份CBPP高免血清和150份无牛肺疫血清的检测结果表明,ELISA方法的敏感性为95%(95/100),特异性为98%(147/150)。应用间接ELISA和补体结合试验(CFT)对来自3个省自治区3817头份牛血清进行了检测,Kapaa值为0.701,两种方法的存在中、高度一致。 在病原诊断PCR方法研究方面,设计合成了MC1、MC2和SC1、SC2两对引物。MC1、MC2是一对簇特异性引物,用于鉴别丝状支原体簇6个成员,对MmmSC、MmmLC扩增出与预期结果相符的462bp片段;而SC1、SC2是针对MmmSC的一对特异性引物,只能对MmmSC扩增出277bp的片段,经过VspI、Bsp143I和DraI三种限制性内切酶鉴定与预期结果相符,而不能扩增出MmmLC型Y-goat代表株,说明具有非常好的特异性。对MmmSC进行的敏感性试验显示SC1、SC2引物能够检测到100个CFU,具有非常高的敏感性。利用该方法在新疆进行了疑似肺脏的病原检测,共采集肺脏可疑样品83份,PCR结果显示均为阴性,与血清学检测结果相符。 在分子流行病学研究方面,收集了6株来自中国不同地区历史流行的MmmSC毒株与分离自非洲的MmmSC标准株PG1、MmmLC代表株Y-goat进行分子特征比较。长片段PCR扩增结果显示6株中国分离株与PG1、Y-goat都没有缺失8.84kb片段。LppB基因及编码的蛋白质存在于所有的非洲群中,但在欧洲群中却不存在。比较发现6株中国分离株LppB全基因序列与PG1同源性达99%以上,而与Y-goat同源性小于93%。利用重组表达的PG1株LppB蛋白C端制备的抗血清在Western-blot试验中可以与PG1、Y-goat以及6株中国分离株在66kDa处发生杂交反应,表明LppB基因及编码蛋白质存在于6株中国分离株中。利用多重序列分析试验(multilocus sequence analysis MLSA)对包括6株中国分离株在内的不同地区菌株进行序列比较,进一步表明6株中国分离株与非洲-澳大利亚群菌株相同,选择性引物的扩增结果也支持这一结果。根据以上分析结果,可以认为中国流行的MmmSC在分子特征上与非洲-澳大利亚群完全相同。 通过上述研究在国内首次建立了敏感、特异适用于基层应用的间接ELISA方法,在内蒙古、新疆等省区应用获得了良好的评价。建立了病原特异性PCR诊断方法,可以在8个小时内获得疑似样品的诊断结果,应用该方法在新疆进行了疑似牛肺脏样品的检测,与病原分离以及血清学检测结果相一致。通过对6株来自中国不同地区历史流行的MmmSC毒株的分子特征分析,首次提出我国流行的MmmSC在基因特征上与非洲-澳大利亚群相同,进一步推断出我国流行的CBPP是由于引进澳大利亚牛而传入的。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S858.23

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【引证文献】
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中国重要报纸全文数据库 前10条
1 高峰 周领辉 李茹阁;冬春谨防猪的传染性胸膜肺炎[N];中国畜牧报;2003年
2 保定市冀中兽药厂事业部 张玉英;羊传染性胸膜肺炎[N];中国畜牧报;2004年
3 高峰 周领辉 李茹阁;冬春 谨防猪的传染性胸膜肺炎[N];中国畜牧报;2003年
4 邢台市兽医院 邢兰君;猪瘟与传染性胸膜肺炎混感的诊治[N];河北科技报;2010年
5 邢台市兽医院 邢兰君;小尾寒羊传染性胸膜肺炎的诊治[N];河北科技报;2009年
6 李进军;综合防制出羊痘和传染性胸膜肺炎并发症[N];江苏农业科技报;2004年
7 阜平县畜牧局 吕记栓;猪传染性胸膜肺炎咋防治[N];河北科技报;2010年
8 ;一例副猪嗜血杆菌和传染性胸膜肺炎混合感染的治疗心得[N];中国畜牧兽医报;2009年
9 ;一例副猪嗜血杆菌和传染性胸膜肺炎混合感染的治疗心得[N];中国畜牧兽医报;2009年
10 翟洪民;养羊要重四消毒[N];山西科技报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 储岳峰;我国山羊(接触)传染性胸膜肺炎病原学、流行病学研究及灭活疫苗的研制[D];中国农业科学院;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张萍慧;内蒙古地区羊传染性胸膜肺炎病原的分离鉴定及某些生物学特性研究[D];内蒙古农业大学;2010年
2 李志远;杂交盘羊传染性胸膜肺炎支原体的分离和鉴定[D];石河子大学;2010年
3 汪代华;桑白皮对氟苯尼考在传染性胸膜肺炎山羊的药代动力学影响研究[D];四川农业大学;2006年
4 毕崇亮;山东省山羊传染性胸膜肺炎抗体水平调查及病原分离鉴定[D];山东农业大学;2013年
5 程亚楼;猪的六种常见致病菌基因芯片检测技术的研究[D];河南农业大学;2013年
6 郝瑞霞;绵羊肺炎支原体的分离鉴定及全基因组序列的测定和分析[D];内蒙古农业大学;2012年
7 陈辉;恩诺沙星粉治疗猪传染性胸膜肺炎的药效学及安全性评价初步研究[D];南京农业大学;2012年
8 张斯民;绵羊肺炎支原体甘油-3-磷酸氧化酶基因的克隆、表达及重组产物的纯化[D];宁夏大学;2013年
9 张明月;羊肺炎支原体内蒙古分离株的同源性研究及双重PCR检测方法的建立[D];内蒙古农业大学;2012年
10 张仁良;副猪嗜血杆菌,猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌2型三重PCR方法的建立与应用[D];南京农业大学;2011年
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