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《吉林农业大学》 2008年
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小反刍兽疫(PPR)ELISA及PCR诊断方法的建立

张喜悦  
【摘要】: 小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒属小反刍兽疫病毒引起的一种山羊和绵羊的急性或亚急性病毒病,临床上以高热、坏死性胃炎、胃肠炎和肺炎为特征。该病首次报道是在科特迪瓦,现发生在撒哈拉以南和赤道以北的多数非洲国家,中东到土耳其的几乎全部国家。近年来该病持续向东传播,我国周边的印度、尼泊尔等国家也先后爆发了小反刍兽疫。 我国与印度、尼泊尔等国家有很长的边境线,这些边境地区有高原、山地及荒地的存在,存在着多种野生小反刍兽,在周边国家感染PPRV后,经迁徙将PPRV存入我国的可能性很大。PPR爆发将会影响我国的养羊业,同时也会对包括2008年奥运会吉祥物的藏羚羊在内的多种濒危野生动物造成打击。为防范小反刍兽疫传入我国,应首先建立小反刍兽疫的诊断技术。 PPR诊断方法主要包括血清学诊断方法和病原学诊断方法。血清学诊断方法中应用最多的ELISA方法,而病原学诊断方法中使用最为广泛的则是PCR方法。本论文先后建立了以PPRV N蛋白为抗原的ELISA试验和以N蛋白为靶蛋白的RT-PCR技术。本论文主要包括以下几方面的研究工作: 1 PPRV N基因的合成与N蛋白的表达从GenBank中下载多株PPRV病毒的N基因片断序列,用MegAlign软件分析它们的进化关系,选取PPRV Turkey 2000株基因组全序列(序列号为AJ849636)作为模板,截取N基因CDS序列(108-1685);根据大肠杆菌密码子偏好调整密码子,并改变基因编码区内NcoⅠ和HindⅢ的酶切位点处的碱基组成。确定序列后经公司合成,获取了PUC-PPRV-N质粒;用NP1和NP2引物大量扩增PPRV-N基因,并提取pET32-H质粒。提取的pET32-H质粒和回收的PPRV-N基因PCR产物用NcoⅠ和HindⅢ酶进行双酶切,并回收目的片段;在T4DNA连接酶的作用下,纯化的PPRV-N基因和pET32-H载体进行连接反应,构建了含有PPRV N基因的重组质粒pET32-PPRV-N;将pET32-PPRV-N大肠杆菌菌种接于含氨卞青霉素(AMP)的LB固体培养基上,经诱导后可以表达出分子量约65000的蛋白;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blotting检测,可鉴定为PPRV N蛋白。 2 PPRV N蛋白的纯化与间接ELISA方法的建立菌种经37℃震荡培养后,测OD值,当OD值达到0.5-0.6时,加入IPTG终浓度为1mol/L,37℃经4h诱导表达。将菌液离心,菌体沉淀用1×binding buffer悬浮,超声波裂解,离心取上清,加入已处理好的层析柱,以每h10倍柱体积的流量过柱。随后分别用10倍体积1xBinding Buffer、6倍体积1xWashBuffer、6倍体积1xELute Buffer洗涤层析柱,收集1xELute Buffer的洗脱液,加入超滤管中进行浓缩与除盐,经蛋白核酸测定仪上进行浓度后将蛋白分装保存备用。 制备免疫血清,用国际标准阳性血清进行标定,按照标定的梯度稀释后作为参考阳性血清。以PPRV N蛋白为抗原包被酶标板,形成了最终的ELISA程序。PBS稀释纯化好的PPRV-N蛋白,使其终浓度为3ug/ml;37℃作用3h后4℃包被过夜,次日用0.1%BSA 37℃封闭1h;待检血清用0.1%BSA-PBST作1:40稀释,加入包被板,37℃作用40min;酶标蛋白G作1:10000稀释后,加入包被板,37℃作用40min;加入TMB底物37℃作用15min后用H_2OS_4终止反应;测定OD_(450)值,计算每一样品的S/P值并判定结果。 从山东省地方采集467份羊血清,使用建立的ELISA程序进行检测,计算不同血清的样品OD_(450)值/阳性参考血清OD_(450)值(S/P)值,S/P值用平均值加3倍标准差,计算出其临界点为0.27。同时应用I-ELISA方法和C-ELISA方法检测来自于疫区的69份血清。两者之间的符合率为79.7%((8+47)/69);与用以病毒裂解物为抗原、H蛋白的单抗为基础的C-ELISA方法相比较,我们的PPRV重组N蛋白间接ELISA方法的特异性为94%(47/50),敏感性为42%(8/19)。 3 PPRV N基因的反转录RT-PCR程序的建立培养含有PPRV N基因片断的大肠杆菌JM109,使用碱裂解法提取小量PUC-PPRV-N质粒,以N基因的前20个碱基作为上游引物(NP1),最后20个碱基的反向序列作为下游引物(NP2)大量扩增PPRV-N基因;使用小量胶回收试剂盒法回收PPRV-N基因,连接到pGEM-T载体;将连接产物pGEM-T-PPRV-N转化至E.coli DH5a感受态细胞中,并使用蓝白斑试验筛选重组质粒,培养pGEM-T-PPRV-N大肠杆菌;用碱裂解法提取小量pGEM-T-PPRV-N质粒,PeR鉴定后选用Nde I对质粒酶切,进行线性化处理,用酚/氯仿法纯化线性化质粒;测定DNA含量后,用纯化后的线性化质粒作为模板进行体外转录,转录产物纯化后测定其含量,稀释后使其拷贝数最终达到2μL中6×10~(10)个,分装冻存于-80℃后即为RNA阳性对照。 用体外转录产物作为模板,以NP3和NP4作为上下游引物,对PCR反应的复性温度、循环次数、Mg~(2+)浓度、引物浓度等进行优化,确定最佳的PCR反应条件为25μL体系。各反应成分为2.5μL 10×Taq酶缓冲液、2.0μL dNTP、1.0μL MgCl_2、1.0μL NP3、1.0μL NP4、1.0μL模板、1.0μL AMV、1.0μL RNase、0.25μL Taq酶、14.25μLDEPC水。PCR仪程序设置为42℃反转录40min;95℃预变性3min,然后95℃变性30sec,52℃退火30sec,72℃延伸30sec,扩增40个循环之后,72℃延伸7min。提取和犬瘟热、新城疫病毒的RNA作为模板,以体外转录的模板作为阳性对照,结果仅见体外转录模板有扩增,证实了试验的特异性。阳性对照的体外转录产物用DEPC水进行连续10倍倍比稀释后,分别进行PCR扩增,结果PPRV RT-PCR的敏感性为可以检出拷贝数为40的PPRV。 上述研究结果表明:本研究合成了PPRV N基因,表达和纯化了PPRV N蛋白,建立了PPRV N蛋白的间接ELISA方法,该ELISA方法与以抗H蛋白单抗为基础构建的C-ELISA相比较,两者的符合率为79.7%;反转录了PPRV N基因作为阳性对照,以NP3和NP4为引物,建立了PPRV RT-PCR方法。上述PPRV ELISA诊断方法和PCR诊断方法的建立,使我国初步具备了检测PPRV感染的能力。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S858.26

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