收藏本站
《吉林农业大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

木聚糖酶的酶学特性及基因克隆表达研究

苏玉春  
【摘要】: 木聚糖(Xylan)是一种多聚五碳糖,是植物半纤维素的重要组分,它占植物碳水化合物总量的三分之一,在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。它可以将木聚糖降解为寡聚木糖、木糖和少量单糖。它在饲料、造纸、食品、制药以及能源工业中均有着广泛的应用。本论文主要对黑曲霉产木聚糖酶进行了如下研究: 1.黑曲霉培养基的优化。通过单因素试验及正交试验确定了黑曲霉液体发酵产木聚糖酶最适的发酵培养条件为:麸皮80g/L,酵母膏15g/L,Tween80 2g/L,无机盐K_2HPO_4为2.6%,CaCl_2为0.5%,MgSO_4.7H_2O为1%,FeSO_4.7H_2O为0.016%,装液量为50ml/250 ml,培养的起始pH为5.0,培养温度为28℃,培养时间为72 h,摇床的转速为150r/min,在此条件下,菌株产木聚糖酶活性较高,能提高至酶活为85.3U/ml。 2.用双水相法提纯木聚糖酶。本文利用双水相法对木聚糖酶粗酶进行提纯,确定最佳的纯化条件为:PEG4000浓度为19%(w/w)、磷酸氢二钾浓度为10%(w/w)、氯化钠浓度为0(w/w)。在此条件下,木聚糖酶的提取效果较好,K和Yt的值分别为29.34和88.67%。 3.木聚糖酶酶学性质的研究。本论文对黑曲霉产木聚糖酶的酶学性质进行了研究,结果表明:该木聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适pH为5.0,在酸性的条件pH3.0~6.0的范围内稳定性较好,是典型的酸性木聚糖酶;在40~50℃间的热稳定性较好。在金属离子中,Fe~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)对木聚糖酶的酶活有不同程度的促进作用;Al~(3+)对木聚糖酶稍有影响使其活力降低;而其余的大部分金属离子对酶的活性的影响并不大,并没有发现对酶有着明显激活或抑制作用的离子。 4.本论文以黑曲霉菌株基因组DNA和cDNA为模板,通过PCR扩增出得到一条大小约为750bp和680bp的片段,测序结果表明该DNA基因全长746bp,含有68bp的内含子,基因编码区长678bp,目前,该基因已提交Gen Bank,登录号为EU423881。。 将测序所得正确的xynB结构基因与酵母分泌型表达载体pPIC9K进行连接,转化大肠杆菌DH-5α,构建表达载体pPIC9K—xynB。后用电击转化法将重组质粒转化毕赤酵母(Pichia pastorisGS115),经MM/MD快慢斑进行筛选,并挑取数个慢斑进行甲醇诱导培养,4~6天后,将其点于RBB-木聚糖平板上,可见产生了明显的透明圈。工程菌SMD-xynB-2木聚糖酶产量达到216U/ml,比原出发菌株提高了2.53倍,表达产物具有生物学活性,分泌到细胞外,可溶且木聚糖酶的表达具有良好的遗传稳定性。重组木聚糖酶的酶学性质与原始木聚糖酶基本相同,分别为最佳反应温度为50℃,最适pH约为5.0,热稳定性和原菌株相比,在40℃~70℃时变化不明显,80℃比原菌株下降0.2%。探索了不同碳源、不同氮源及甲醇的添加量对重组酵母产木聚糖酶的影响,结果表明:最佳的碳源为麸皮,最佳的氮源为牛肉膏,甲醇的添加量为0.5%诱导效果最好。SDS-PAGE电泳表明,重组酵母产木聚糖酶的分子量约为24KD。 5.以紫花苜蓿无菌苗的下胚轴、子叶、叶片和叶柄为外植体,研究了不同培养基、不同激素种类和配比对胚性愈伤组织诱导的影响,以及不同分化培养基对胚状体分化的影响。结果表明:下胚轴外植体胚性愈伤组织诱导率最高;最佳胚性愈伤组织诱导培养基为改良SH+2.0mg/L2.4-D+0.5 mg/L6-BA;最佳胚状体诱导培养基为MSO+2.0 mg/L6-BA+0.5mg/LNAA;成苗培养基为1/2MS+1%蔗糖+0.7%琼脂。构建了PBI121-xynB表达载体,经酶切鉴定,构建成功,并转化苜蓿,但转化率低,提取叶片测得酶活为10.5U/g。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q78

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 蔡敬民,吴克,张洁,何晓刚,潘仁瑞;黑曲霉A3木聚糖酶固体发酵研究[J];工业微生物;1997年02期
2 吴克,蔡敬民,潘仁瑞;黑曲霉A3菌株木聚糖酶粗酶制剂的制备和性质[J];微生物学通报;1997年06期
3 张年凤,赵允麟;黑曲霉产木聚糖酶的特性[J];食品与生物技术;2003年05期
4 陈惠忠;高培基;王祖农;;黑曲霉An-76木聚糖酶系的酶学研究[J];微生物学报;1991年02期
5 张建新,李学梅,姜丽娜,聂国兴,张霞,李向力,明红;黑曲霉固态发酵木聚糖酶中试条件的研究[J];微生物学杂志;2003年04期
6 陈惠忠;高培基;王祖农;;产木聚糖酶菌株的选育及其液体发酵条件[J];微生物学报;1990年05期
7 杨瑞鹏;胡慰望;赵学慧;;黑曲霉A_(34)菌株的木聚糖酶分离纯化及其性质研究[J];华中农业大学学报;1991年01期
8 吾尔恩·阿合别尔迪;张云;刘东波;;一株产木聚糖酶菌固体发酵条件的优化[J];伊犁师范学院学报(自然科学版);2011年01期
9 张洁,吴克,蔡敬民,刘斌,刘云峰,潘仁瑞;黑曲霉A3木聚糖酶固态变温发酵及曲盘试验研究[J];合肥联合大学学报;1999年02期
10 刘成;孙中涛;田林茂;杜金华;;黑曲霉产木聚糖酶固态发酵条件及部分酶学性质的研究[J];生物技术;2007年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 徐燕;田宝玉;施巧琴;吴松刚;黄建忠;;黑曲霉IME-216产木聚糖酶的条件优化及基因在酿酒酵母中高效表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年
2 吴克;蔡敬民;潘仁瑞;刘斌;张洁;;丝状真菌木聚糖酶的组成和性质研究[A];酶制剂在饲料工业中的应用[C];2005年
3 蔡敬民;吴克;刘斌;张洁;居盟;潘仁瑞;姚建铭;余增亮;;黑曲霉木聚糖酶诱变育种及其在纤维物质转化中的应用[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年
4 于旭华;冯定远;;真菌性和细菌性木聚糖酶对黄羽肉鸡小麦型日粮体内外营养物质代谢消化率的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会——第九届学术研讨会论文集[C];2004年
5 汤燕花;牛海涛;谢必峰;;黑曲霉Aspergillus niger SL2-111木聚糖酶的分离纯化及其性质[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年
6 连惠芗;汪世华;;木聚糖酶基因的克隆与表达[A];第十届全国杀虫微生物学术研讨会暨全国生物农药与化学生物学研究与产业化会议论文摘要集[C];2006年
7 吴淑芳;尤纪雪;;木聚糖酶对麦草浆漂白机理的探讨[A];中国造纸学会第十届学术年会论文集[C];2001年
8 黄金秀;陈代文;张克英;;仔猪饲粮木聚糖水平与添加木聚糖酶对养分消化率的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会——第九届学术研讨会论文集[C];2004年
9 于旭华;冯定远;;真菌性和细菌性木聚糖酶对黄羽肉鸡消化系统发育和消化酶活性的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会——第九届学术研讨会论文集[C];2004年
10 费笛波;皮雄娥;王龙英;袁超;;适于用作饲料添加剂的黑曲木聚糖酶的性质研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 汤立平;木聚糖酶的性质及在酿酒方面的应用[N];中国食品安全报;2011年
2 ;木聚糖酶的性质及在酿酒方面的应用[N];中国食品安全报;2011年
3 ;木聚糖酶的性质及其在酿酒方面的应用[N];中国食品安全报;2011年
4 记者 施慧;帝斯曼公布黑曲霉基因组DNA序列[N];中国化工报;2007年
5 中国农业大学 陆文清博士;评价饲料酶质量的5种指标[N];中国畜牧报;2005年
6 中国WTO TBT-SPS中心供稿;加拿大修改食品生产中使用菌黑曲霉和派生磷脂酶临时营销许可[N];中国国门时报;2009年
7 何国庆 张灏;在酶制剂生产中的应用(下)[N];中国食品报;2009年
8 陆文清;饲用非淀粉多糖酶高产菌种选育及固态发酵技术通过鉴定[N];中国畜牧报;2004年
9 中国WTO/TBT-SPS中心供稿;加拿大 拟修改食品药物法规[N];中国国门时报;2009年
10 本报通讯员 沈中兴;情系中小企业[N];科技日报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 朱汇源;木聚糖诱导条件下黑曲霉特异基因表达分析及高表达碱性木聚糖酶产黄青霉菌株构建研究[D];山东大学;2010年
2 苏玉春;木聚糖酶的酶学特性及基因克隆表达研究[D];吉林农业大学;2008年
3 孙建义;耐热木聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究[D];浙江大学;2003年
4 刘明启;提高木聚糖酶热稳定性、催化活性和结合水解纤维素能力的研究[D];浙江大学;2007年
5 白爱枝;黑曲霉木聚糖酶的同源表达、发酵及其酶学性质研究[D];内蒙古农业大学;2011年
6 王海;Sp.E-86菌株高产木聚糖酶机理和吸附特性及反应动力学的研究[D];中国农业大学;2002年
7 丁长河;链霉菌高产木聚糖酶及其酶学性质的研究[D];中国农业大学;2003年
8 孙中涛;苹果渣与棉粕固态发酵生产NSP酶的研究[D];山东农业大学;2008年
9 国春艳;木聚糖酶和纤维素酶对后备奶牛生长代谢、瘤胃发酵及微生物区系的影响[D];中国农业科学院;2010年
10 王金全;小麦非淀粉多糖的抗营养机理及木聚糖酶在肉仔鸡小麦日粮中的应用研究[D];中国农业科学院;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李加强;黑曲霉产木聚糖酶液体发酵工艺的研究[D];华中农业大学;2003年
2 李丹;黑曲霉木聚糖酶的发酵、性质及其应用研究[D];东北师范大学;2004年
3 高洁;饲用木聚糖酶固态发酵技术研究与应用[D];山东农业大学;2007年
4 闫欣;黑曲霉双功能木聚糖酶的纯化与酶学性质研究[D];河南农业大学;2006年
5 李运峰;末端氨基酸残基去除对黑曲霉木聚糖酶XynⅢ热稳定性影响[D];河南农业大学;2010年
6 宋敏;S-211枯草芽孢杆菌固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的研究[D];内蒙古农业大学;2011年
7 周煌凯;耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及发酵条件优化[D];西北农林科技大学;2010年
8 廖超登;S7-xyn木聚糖酶的酶学性质及其在麦草浆漂白中的应用[D];华南理工大学;2010年
9 顾赛红;不同木聚糖酶基因在毕赤酵母中表达及酶学特性研究[D];浙江大学;2004年
10 郑晗;低温木聚糖酶对面包品质的影响[D];山东师范大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026