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《长春中医药大学》 2010年
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梅花鹿鹿茸胶原酶解物的制备及活性研究

李银清  
【摘要】: 本文通过优选采用水提法从梅花鹿鹿茸中分离提取出胶原,并通过蛋白酶对其进行水解,增强了胶原的溶解性,得到了鹿茸胶原酶解物(CSDV);采用薄层色谱、高效液相色谱、紫外光谱、红外光谱、圆二光谱现代谱学技术对CSDV的理化性质和蛋白结构组成进行了初步研究;对CSDV的药理活性进行筛选,并对其抗骨质疏松作用进行了药效学实验,最终以梅花鹿茸胶原为基源开发保健食品1种,并制定了相应的质量标准和操作规程。 1采用水提法与酶解法相结合,提取CSDV的工艺研究。 采用Folin-酚试剂法测量胶原蛋白含量,并以此为指标,考察了不同料液比(1:1,1:2,1:3,1:4,1:5)、不同提取时间(1 h,2 h,3 h,4 h,5 h)、不同提取次数(1,2,3,4,5次)三个因素对胶原提取率的影响,通过单因素考察和正交试验发现提取次数对提取率影响最大,提取时间其次,料液比对提取率影响不明显,确定了最佳提取条件,即:料液比1:3,提取4 h,提取5次。在此基础上,采用高效液相分子筛柱检测蛋白分子量,以胶原酶解后分子量为指标,通过单因素考察实验,筛选了酶解时间(0 h,0.5 h,1 h,2 h)和其与底物作用的比值(1:3000,1:5000,1:8000,1:10000)对胶原分子量的影响,优选胰蛋白酶最佳提取条件是酶与底物比为1:5000,酶解时间为2 h。验证试验证实,在料液比为1:3,提取次数为5次,提取时间为每次4 h,酶与底物比为1:5000,酶解时间为2 h条件下提取率最高。通过测试和计算,采用以上工艺得到鹿茸胶原蛋白平均收率为12.52%,平均蛋白含量为56.89%。 2采用现代分析技术手段对CSDV理化性质和蛋白结构组成进行初步研究。 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),测定梅花鹿鹿茸胶原酶解物分子量,结果显示,CSDV分子量集中在31 kDa以下,与高效液相检测到的结果相符合;应用酸水解法,对CSDV氨基酸成分进行分析,分析结果显示在20种常见氨基酸中,含量最高的是甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸,其中甘氨酸含量为32.10%,占了几乎1/3,脯氨酸含量15.50%,丙氨酸为13.87%,甲硫氨酸,酪氨酸和组氨酸含量较低,没有检测出含有胱氨酸,非常见氨基酸—羟脯氨酸的含量也非常高,为6.71%,这一结果符合胶原氨基酸含量特征;TLC薄层色谱检识CSDV与标准品在相同位置出现桃红色斑点;茚三酮显色反应呈蓝紫色;含水量检测结果显示CSDV含水量为8.24%;变温法分析了梅花鹿鹿茸胶原黏度随温度变化情况,结果显示鹿茸胶原溶液具有很高黏度,且黏度随温度升高逐渐降低,温度为20℃以下时,基本失去流动性,胶原酶解后,黏度迅速下降;紫外吸收光谱显示其在260 nm有最大吸收;红外光谱结果说明CSDV中没有新的化学键产生;圆二色谱分析结果显示CSDV中二级结构数量α-螺旋、β-折叠和无规卷曲数量分别为3.6%,42.7%和53.7%。 3对CSDV急性毒性进行了研究。 急性毒性试验表明, 20只小鼠按体重灌胃给予鹿茸胶原酶解物10 g?kg-1?d-1,每日2次,观察14 d。20只小鼠全部存活。说明CSDV属实际无毒级。 4对CSDV小鼠生长和性腺相关脏器的影响。 小鼠血清血糖及睾酮含量检测发现CSDV能够促进小鼠体重的增长速度,使小鼠性腺相关脏器前列腺-贮精囊、睾丸、提肛肌-海绵球肌重量增加,血液中睾酮含量增加,同时,胸腺重量增加,血糖含量下降。说明梅花鹿茸胶原酶解物能促进小鼠生长和性腺器官的发育,降低血液中葡萄糖含量。 5对CSDV抗炎免疫抗应激作用进行了研究。 急性特异性免疫实验结果表明,CSDV在0.2 g?kg-1剂量下对小鼠角叉菜胶引起的足肿胀有抑制作用,P﹤0.05;当剂量为0.5 g?kg-1和0.25 g?kg-1时对DNCB所致小鼠迟发型超敏反应有抑制作用,并可一定程度促进小鼠巨噬细胞吞噬功能;抗应激实验结果表明,剂量0.5 g?kg-1时,可延长小鼠存活时间;1.0 g?kg-1、0.5 g?kg-1和0.25 g?kg-1均可延长小鼠游泳时间,只有在1.0 g?kg-1和0.5 g?kg-1时差异明显。 6采用去势和维甲酸两种方法造模对CSDV防治骨质疏松症作用进行了研究。 对去势雌性大鼠骨质疏松症防治作用实验结果表明,与正常对照组比较,模型组大鼠骨密度降低(P0.01),血清生化指标骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)、雌二醇(E2)、血清磷(S-P)、血清钙(S-Ca)指标变化均有统计学意义,骨生物力学指标明显改变:最大载荷、最大挠度、骨应变都减小或变弱,骨形态计量学指标骨小梁占视域面积百分数(TBV)减少、平均骨小梁间距(MTPS)明显增大、平均骨皮质厚度(MBCT)明显变大,说明造模成功;经CSDV治疗后,上述指标除E2、S-P、S-Ca、MBCT外均明显改善,剂量在0.4 g?kg-1时防治作用最显著。 对维甲酸致大鼠骨质疏松症防治作用试验结果表明,与对照组比较,模型组大鼠骨密度降低(P0.01),血液生化骨转换指标S-Ca降低,骨组织静态计量学指标变化明显:骨小梁占视域面积百分数比正常对照组减少了近50%,骨量丢失明显,MTPS明显增大(P0.001)、MTPT明显变窄(P0.001)、MBCT明显变大(P0.001),骨生物力学各项指标明显改变:最大载荷、最大挠度、骨应变减弱或变小,说明造模成功;经与CSDV干预组对比,上述指标都出现了明显的改善,骨密度增加(P0.05),ALP降低,S-Ca、S-P升高,骨量明显增加,骨小梁形态发生逆转、数量明显增加、间距变窄等,综合比较剂量在0.2 g?kg-1时预防作用最显著。 7对CSDV抗辐射功效进行了研究。 从通过外周血白细胞计数实验、骨髓细胞DNA含量和骨髓细胞微核实验以及血常规检测等试验,针对鹿茸CSDV抗辐射功效做了系统评价。结果显示,CSDV只可显著降低由γ射线照射引起的骨髓细胞微核数增高。 8通过细胞实验检测了CSDV体外促细胞贴壁作用。 采用预先铺被CSDV方法,在6孔板中加入鹿茸胶原酶解物2 ml/孔。分别将3T3细胞,Vero细胞和分离得到大鼠乳鼠颅顶骨成骨细胞,接种于铺被胶原的培养板,培养24 h,结果显示CSDV在促进细胞贴壁方面作用不明显。 9梅花鹿茸“强筋壮骨”功效保健食品的开发。 以梅花鹿茸胶原为基源,在药效学实验基础上,开发出具有增加骨密度功效的保健食品——鹿茸胶原咀嚼片。对其生产工艺进行了研究,并进行了中试实验,制定了成品质量标准。
【学位授予单位】:长春中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R283

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