重楼皂苷抗乳腺癌及免疫调节作用研究
【摘要】：乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,目前乳腺癌的治疗方法通常有手术治疗、放射治疗、内分泌治疗、化学药物治疗、免疫治疗及中医中药治疗等。近年来放疗、化疗发展迅速,手术方法不断改进,使患者的生存质量和预后有了很大的改善。其中化疗是癌症治疗中最常用的方法之一,但是单独化疗却很难达到令人满意的治疗效果。一般认为辅助化疗应予术后早期应用,联合化疗的效果优于单药化疗。因此寻找一种防治乳腺癌的高效低毒药物是目前研究的热点。
重楼作为我国传统中药,具有退烧、解毒、消肿、镇痛、止血等作用。本研究采用乙醇提取后正丁醇萃取方法提取重楼皂苷,研究了其在体内和体外对MCF-7人乳腺癌细胞株的抑制作用,并深入研究了其抗癌机理,获得如下结果。
在离体试验中,RPS对MCF-7人乳腺癌细胞株呈明显的生长抑制性,并有显著剂量依赖性,其IC_(50)为71.2±2.3μg/mL。通过Annexin V-FITC/PI双染法对RPS处理的MCF-7人乳腺癌细胞进行细胞凋亡检测发现,随着RPS浓度的提高,早期凋亡细胞明显增加。对MCF-7人乳腺癌细胞线粒体膜电位进行检测,发现随着RPS浓度升高,线粒体膜电位逐渐降低,说明此时细胞已接收到凋亡信号,开始启动凋亡程序。用Western Blot手段对MCF-7人乳腺癌细胞内各凋亡相关因子进行检测,结果显示同对照组相比,随着RPS浓度增加,活化的PARP、Caspase-3和Caspase-9含量有所提高,而Bax/Bcl-2的比值显著上升(P0.05),细胞质内细胞色素C的含量也有明显提高。结果表明随着RPS浓度增加,细胞开始执行线粒体介导的细胞凋亡途径,主要包括线粒体膜电位的降低,Bax/Bcl-2比率的提高,线粒体细胞色素C的释放,PARP的活化以及Caspase级联反应的激活。
荷瘤裸鼠给予高、低剂量的RPS灌胃14 d后,其肿瘤生长明显受到抑制,肿瘤抑制率分别为43.14%和38.90%,且对肝脏和肾脏无明显毒性。
同对照组相比,RPS高、低剂量处理均可显著提高荷瘤裸鼠的胸腺指数(P0.01),但是对脾脏组织则无明显保护作用。
通过对荷瘤裸鼠血清相关细胞因子测定,荷瘤裸鼠血清IFN-γ和IL-2水平均显著升高,IL-4水平显著降低(P0.05),从而使机体内Th1/Th2平衡向Th1偏移;同时,RPS处理可降低血清中TNF-α水平,从而使肿瘤细胞失去生长条件,最终得以抑制肿瘤生长。
RPS处理可显著提高荷瘤裸鼠血清总抗氧化能力(T-AOC)水平(P0.01)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)水平(P0.05),显著降低血清丙二醛(MDA)水平(P0.05)。对荷瘤裸鼠肝脏、肾脏进行分析发现,组织中T-AOC和T-SOD水平都有显著提高(P0.05),但是对谷胱甘肽还原酶(GR)水平无显著影响(P0.05)。
本文以Balb/c荷瘤裸鼠和MCF-7人乳腺癌细胞株为试验材料,通过体内外试验,运用HE染色法、ELISA法、MTT法、流式细胞术和Western Blot技术等方法对肿瘤相关蛋白、细胞因子、肿瘤组织病理结构和细胞凋亡等参数进行分析,系统研究了RPS抗乳腺的作用及其内在机理,为RPS治疗乳腺癌提供了一定的科学依据和理论基础。
【关键词】：重楼皂苷 乳腺癌 免疫调节 抗氧化 细胞凋亡 【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R285.5;R737.9
【目录】：
- 中文摘要4-6
- 英文摘要6-11
- 引言11-23
- 1 研究背景11
- 2 中医药抗癌的研究现状11-18
- 2.1 中医抗癌理论的研究12
- 2.2 中药成分抗肿瘤作用的研究进展12-14
- 2.3 中药抗肿瘤分子机理的研究进展14-18
- 3 中药重楼的研究现状18-22
- 3.1 化学成分18-19
- 3.2 药理作用19-21
- 3.3 临床应用21-22
- 3.4 问题与展望22
- 4 本文的主要研究内容和意义22-23
- 第一章 重楼皂苷体外抗乳腺癌作用的研究23-33
- 1 试剂和器材23-24
- 1.1 试剂23-24
- 1.2 细胞株24
- 1.3 主要器材24
- 2 试验方法24-26
- 2.1 重楼皂苷的制备24
- 2.2 细胞培养24
- 2.3 MTT 法检测细胞增殖作用24-25
- 2.4 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡25
- 2.5 线粒体膜电位检测25
- 2.6 Western Blot 分析25-26
- 2.7 细胞质中细胞色素C 的检测26
- 2.8 统计分析26
- 3 结果26-29
- 3.1 RPS 对细胞增殖的影响26-27
- 3.2 凋亡检测27
- 3.3 线粒体膜电位检测27-28
- 3.4 Western Blot 分析28-29
- 3.5 RPS 介导的细胞色素C 的释放29
- 4 讨论29-32
- 4.1 RPS 对MCF-7 人乳腺癌细胞株的增殖抑制效果30
- 4.2 RPS 对MCF-7 人乳腺癌细胞株的凋亡检测30-31
- 4.3 RPS 对MCF-7 人乳腺癌细胞株细胞凋亡相关蛋白表达的影响31-32
- 5 本章小结32-33
- 第二章 重楼皂苷对裸鼠乳腺癌移植瘤的作用及机理研究33-44
- 1 试剂和器材33-34
- 1.1 试剂33
- 1.2 细胞株33
- 1.3 实验动物33-34
- 1.4 主要器材34
- 2 实验方法34-36
- 2.1 细胞培养34
- 2.2 动物模型的建立及分组给药方法34
- 2.3 试验样本采集34-35
- 2.4 RPS 对荷瘤裸鼠体重增长和肿瘤抑制率的影响35
- 2.5 RPS 对荷瘤裸鼠胸腺及脾脏重量指数的影响35
- 2.6 荷瘤裸鼠肝、肾和肿瘤组织细胞形态学的检测35
- 2.7 RPS 对荷瘤裸鼠血清抗氧化能力的影响35-36
- 2.8 RPS 对荷瘤裸鼠肝、肾、胸腺、脾脏和肿瘤组织抗氧化能力的影响36
- 2.9 RPS 对荷瘤裸鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2 和IL-4 含量的影响36
- 3 试验结果36-40
- 3.1 RPS 对荷瘤裸鼠体重增长和肿瘤抑制率的影响36
- 3.2 RPS 对荷瘤裸鼠胸腺及脾脏重量指数的影响36-37
- 3.3 荷瘤裸鼠肝、肾和肿瘤组织细胞形态学观察37-38
- 3.4 RPS 对荷瘤裸鼠血清抗氧化能力的影响38-39
- 3.5 RPS 对荷瘤裸鼠肝、肾组织抗氧化能力的影响39-40
- 4 讨论40-43
- 4.1 动物模型建立的重要意义40
- 4.2 RPS 对荷瘤裸鼠免疫器官的影响40-41
- 4.3 RPS 对荷瘤裸鼠肝、肾的毒性41
- 4.4 RPS 对荷瘤裸鼠肿瘤组织形态的影响41
- 4.5 RPS 对荷瘤裸鼠血清抗氧化能力的影响41
- 4.6 RPS 对荷瘤裸鼠肝、肾组织抗氧化能力的影响41-42
- 4.7 RPS 对荷瘤裸鼠血清细胞因子的影响42-43
- 5 本章小结43-44
- 结论和创新点44-45
- 参考文献45-52
- 附录52-53
- 致谢53-54
- 在学期间公开发表论文及著作情况54
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