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原位细胞电化学检测方法及对氯酚类污染物的毒性测定研究

秦洪伟  
【摘要】:全球日常使用的有机合成品已达10万种之多,其中多数合成化学品没有经过严格的安全性检验。化学品使用后通过各种途径以母体或其产物等形式进入到环境中,大部分在水体中形成残留,引起水体污染。然而目前水质检测多以理化分析为主,其测定结果无法准确反应水体污染现状和污染物的毒性。毒理学实验是水环境中污染物毒性评价的重要途径,但传统的毒理学方法无法满足有害化学物质暴露急剧增加及大量新化合物的评价需求。因此,研究开发简单、快速、灵敏、低成本,同时反映受试生物特性的毒理学评价方法与技术已成为环境监测领域的热点问题。 体外细胞电化学法作为新的技术手段,由于具有设备简单、灵敏度高、检测快速、费用低、无需标记、无毒性和样品可重复利用等优点,已经在细胞活性检测中展现了较好的应用前景。因此,应用细胞电化学法对化学品的毒性进行评价可为水环境安全性评价和环境污染物的毒性评价提供新的技术方法。 本文以人乳腺癌(MCF-7)细胞和人宫颈癌(HeLa)细胞为模型细胞,采用电化学检测法、高效液相色谱分析法测定了细胞裂解液的电化学响应行为,分析了细胞内具有电化学活性物质的种类和含量,建立了双信号细胞电化学检测方法和原位细胞电化学检测方法。并应用所建方法跟踪描述细胞的生长曲线,评价细胞生长抑制剂对细胞生长的影响,考察了该方法评价细胞活性的可靠性。运用原位细胞电化学法评价了氯酚类污染物对模型细胞的毒性,提出了基于细胞裂解液伏安行为的原位细胞电化学检测环境污染物毒性的新方法,使环境污染物毒性检测变得更加简单、快速、客观和灵敏。 具体结果如下: 1、建立了双信号电化学法评价细胞活性体系。为扩大细胞电化学检测的响应电位,探寻更多的细胞电化学响应来源,本论文在已有研究(即细胞电化学响应信号Ⅰ来源于黄嘌呤和鸟嘌呤的电化学氧化反应)基础上,采用多壁碳纳米管和离子液体混合体系对电极进行了修饰,增大了电化学检测系统的电位窗,并研究了MCF-7细胞的电化学响应行为,首次在+1.0V以后检测到明显的不可逆的氧化峰(信号Ⅱ),发现其来源为细胞质内腺嘌呤和次黄嘌呤的氧化反应。在此基础上建立了双信号电化学检测系统,运用电化学法跟踪描述了细胞的生长曲线,研究了肿瘤细胞生长抑制剂金雀异黄素对细胞生长的影响,并计算了IC50值。采用传统的MTT法验证了双信号电化学法的可靠性,结果表明,双信号细胞电化学法可以准确的描述细胞生长状态,但与MTT法相比,信号Ⅰ检测结果更为准确,且以信号Ⅰ为指标测得的IC50值低于MTT法,说明本研究所建立的基于MCF-7细胞伏安响应行为的电化学细胞活性评价方法在一定程度上比传统的MTT法更灵敏。 2、建立了原位电化学法评价细胞活性体系。采用传统细胞处理方法和原位细胞处理方法获得传统细胞裂解液和原位细胞裂解液,并检测其电化学响应信号。结果发现,原位细胞处理方法可以显著提高细胞的电化学响应,且原位细胞裂解液的电化学响应信号来源于细胞质中黄嘌呤与鸟嘌呤的电催化氧化反应。使用原位电化学法评价了细胞生长抑制剂环磷酰胺对MCF-7细胞和HeLa细胞活性的影响。结果发现,随着毒物作用时间和作用剂量的增加,细胞活性不断下降,细胞裂解液的电化学响应信号也随之下降,且具有时间效应和剂量效应关系。采用MTT法验证原位电化学法评价细胞活性的可靠性,结果发现两种方法检测结果基本一致,说明原位细胞电化学法评价细胞活性是可行的。与MTT法相比,原位细胞电化学法简化了操作步骤,降低了实验成本,减少了实验时间;由该方法测得的环磷酰胺对模型细胞毒性的IC50值明显小于MTT法获得的结果,说明基于原位细胞裂解液伏安行为所建立的细胞电化学检测方法可以简单、快速、可靠、灵敏的评价细胞活性。 3、构建了氯酚类污染物细胞毒性的原位电化学检测方法。运用所建立的原位电化学检测细胞活性的方法,测定了五氯酚(PCP)、2,4,6—三氯酚(TCP)和2,4—二氯酚(DCP)对MCF-7细胞和HeLa细胞生长的影响,评价了氯酚类污染物的细胞毒性,计算了IC50。结果表明,三种氯酚类污染物对MCF-7细胞和HeLa细胞的毒性具有时间和剂量依赖性,即随着污染物作用时间和浓度增加,毒性作用不断增强。同时采用MTT法验证了原位电化学法检测环境污染物细胞毒性的可靠性,两者的检测结果基本一致,三种氯酚类污染物对模型细胞的毒性顺序为:PCPTCPDCP,且原位电化学法测得的氯酚类污染物对模型细胞的IC50值小于MTT实验测得值。说明原位细胞电化学法评价环境污染物细胞毒性更为灵敏、可靠。同时发现基于HeLa细胞电化学行为进行污染物毒性检测可获得更低的IC50值,表明与MCF-7细胞相比,HeLa细胞对环境污染物更敏感。


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