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《东北师范大学》 2016年
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大豆花叶病毒病抗病基因的筛选及GmSN1基因的功能验证

贺红利  
【摘要】:大豆花叶病毒病(Soybean Mosaic Virus,SMV)是大豆生长过程中,对大豆产量和品质都会产生严重影响的一种病害。它的病原体是大豆花叶病毒,属于马铃薯Y病毒属(Potato virus Y,PVY)的一种。根据不同的鉴别寄主(不同的大豆品种),对大豆花叶病毒具有不同的生理小种划分方法,不同的大豆品种对不同的大豆花叶病毒生理小种的抗性也并不相同。虽然已有文献报道对大豆花叶病毒病的抗性基因进行了定位,但是很多抗性基因的功能和抗性机理都还没被深入的研究。本实验的目的是利用R-SMV(对大豆花叶病毒病SN1和SN3生理小种免疫)和S-SMV(对两个生理小种都感病)两个大豆品种,通过芯片实验分析二者的基因表达差异,期望找到对大豆花叶病毒病的主效抗性基因,并进一步对R-SMV的抗病机理分析说明。实验为了分离、鉴定大豆抗花叶病毒病基因,更进一步对其抗病机理进行深入研究,选择对花叶病毒抗病的大豆品种R-SMV和感病品种S-SMV,在接种大豆花叶病毒后,对其取材进行基因芯片表达谱研究。经过对R-SMV和S-SMV的差异表达基因分析(4倍及以上差异),发现共有7791个探针至少在一种比较中发生了差异表达:其中,抗病品种R-SMV接SMV与接缓冲液模拟对照相比有3226个;感病品种S-SMV接SMV与接缓冲液相比有3106个;R-SMV接缓冲液与S-SMV接缓冲液模拟对照相比1509个;R-SMV接SMV与S-SMV接SMV相比5083个;共有2168个探针在上调表达和下调表达基因中有重复。从中可以看出,抗病品种和感病品种的模拟对照(接缓冲液)之间有表达变化的探针比较少,而处理(接SMV)之间有表达差异的探针比较多,是对照的三倍多。通过AGRIGO对差异基因功能富集分析,R-SMV之所以对SMV有抗性可能是因为:1.其受病毒侵染后比S-SMV调动了更多与生长相关的基因;2.生物机制抑制了SMV的移动;3.与S-SMV相比其对植物激素的不同响应模式,可能也是其抗病的原因。已报道的抗病基因大多数都含有保守的抗病结构域,实验利用已知的抗病保守结构域,对差异基因做了进一步的筛选,这样发现了17个探针在R-SMV接病毒与接缓冲液比较中表达上调,同时在S-SMV接病毒与接缓冲液比较中没有表达差异。经过大豆的遗传转化实验已经验证了其中的3个基因(GmCnx1、GmAKT2、KR3)过表达以后,证实可以提高大豆对大豆花叶病毒病的抗性。感病品种S-SMV之所以对SMV感病,很可能是相关抗病基因在感染病毒后基因表达下调所致,所以实验又筛选在S-SMV接SMV与接缓冲液相比基因表达下调倍数超过16倍的探针,得到含有GASA结构域的基因7个、AUX/IAA家族基因4个、含有LRR结构域的基因5个、还有2个细胞色素P450家族基因,共18个基因。实验对这些基因进行了克隆,并将其中16个基因成功构建到了gateway植物过表达载体上。为了快速鉴定这些基因的抗病毒功能,将构建好的载体通过浸花法转化拟南芥,经过对过表达大豆抗病毒候选基因的转基因拟南芥抗芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus,TuMV)能力检测,发现一个含有GASA结构域的基因,因其与SN1基因同源性比较高而命名为GmSN1。为深入探索GmSN1基因的抗病毒机理,研究进行了GmSN1转基因拟南芥转录组测序分析,经过对差异表达基因的基因功能富集分析发现,同大豆芯片结果相似,证实在GmSN1转基因系中与生长相关基因的表达上调、而BK对照系中的细胞死亡相关基因的表达上调,从而导致了GmSN1转基因系和BK对病毒病的抗性差异。为了进一步证实Gm SN1基因在大豆中的抗病毒作用,又将其转入栽培品种P3中进行过表达,在得到的转基因株系中,也证实了GmSN1具有提高大豆对大豆花叶病毒病抗性的能力。
【学位授予单位】:东北师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S435.651

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