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病毒载体诱导转录后基因沉默系统的建立及烟草(Nicotiana benthamiana)rbcS基因功能的研究

周晓馥  
【摘要】: RNA沉默是一种序列特异性的RNA降解过程,主要作用于同源性较高的转录产物,它广泛存在于各种生物中,在植物中称转录后基因沉默(Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS)、动物中称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)、真菌中被称为RNA压制(RNA quelling)。病毒诱导转录后基因沉默是由携带基因片段的病毒载体感染植物引起相应的寄主基因沉默的现象,是一种典型的RNA沉默现象。 本论文建立了病毒载体诱导转录后基因沉默系统,并运用该体系研究烟草(Nicotiana benthamiana)的1,5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(Ribulose—1,5—bisphosphate(RuBP)carboxylase/oxylase small subunit,rbcS)基因的部分功能。 具体包括以下内容:1、分别用携带与1,5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(rbcS)基因同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体(pTV.rbcS)和马铃薯X病毒载体(pgR107.rbcS)侵染烟草(Nicotiana benthamiana),诱导内源rbcS基因沉默;2、分别用携带与八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)基因同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体(pTV.PDS)和马铃薯X病毒载体(pgR107.PDS)侵染烟草(Nicotiana benthamiana),诱导内源PDS基因沉默;3、利用携带与绿色荧光蛋白(GFP)同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体(pTV.P)侵染转基因烟草(Nicotiana benthamiana 16c),诱导转基因烟草的GFP基因沉默。4、运用该沉默系统在以下几个水平研究rbcS基因功能:(1)、rbcS基因沉默后的表型分析;(2)、rbcS基因沉默后的转录水平分析;(3)、rbcS基因沉默后的蛋白质表达水平分析;(4)、运用HPLC方法,定量分析rbcS基因沉默后的光合色素变化;(5)、用红外气体分析仪(LI-6400P,LI-COR Inc.)测定烟草rbcS基因沉默的一些重要生理指标;(6)、用两因素方差分析模型和F检验结合分子生物学证据分析病毒载体作为研究基因功能的媒介的可行性以及运用病毒诱导转录后基因沉默系统研究核酮糖1,5二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因功能 的可行性。 通过对上述问题的研究,我们得出以下结论:()建立、完善、优 化了病毒诱导转录后基因沉默系统,确定了病毒诱导基因沉默瞬时表 达体系中烟草最佳侵染时期(六叶期刀-24天)和用于侵染的重组农 杆菌的浓度(OD值为l~1.5);(二)初步揭示了转基因植物与非转基因 植物在基因沉默机制上的异同;(3)烟草脆裂病毒载体比马铃薯X病 毒载体在农杆菌介导的病毒诱导转录后基因沉默体系中更具优势;(4) 烟草RllbiSCO小亚基的表达量动态地调节了RllbiSCO大亚基的表达量; (5)烟草 RbcS基因与光合作用中的光能收集无关;(6)烟草 RbcS 基因在调控RubiSCO活性方面起着重要作用;()烟草RbCS基因在调 控RubiSCO的竣化效率方面起着重要作用;(8)方差分析中的两因素 方差分析和 F枪验证据表明:烟草脆裂病毒载体作为研究核酮糖 1,5 二磷酸竣化酶/加氧酶小亚基基因功能的媒介具有可行性,而马铃薯 X病毒载体具有一定的局限性。


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