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《东北师范大学》 2004年
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壳聚糖纳米载体研究

徐忻  
【摘要】:利用碱化氯乙酸-异丙醇法制备了羧甲基化壳聚糖,收率87.8%,取代度 74.6%。利用氯磺酸吡啶法制备硫酸化壳聚糖收率110.67%,离子色谱法(IC)测定得 硫酸根含量33.95%,碱性多糖于环氧乙烷冰浴法制备羟乙基化壳聚糖,收率87%,通过红外光谱法分析确定了各取代基团的数量和位置。 将羧甲基化壳聚糖、硫酸化壳聚糖、羟乙基化壳聚糖用于制备可调控释放时间的纳米药物载体,采用反相微乳化法,以胰蛋白酶为模式药物,按照衍生化壳聚糖比壳聚糖 1:3的比例混合样品,利用戊二醛为交联剂,十二烷基璜酸钠为乳化剂,分别制备了羧甲基化壳聚糖/壳聚糖、硫酸化壳聚糖/壳聚糖、羟乙基化壳聚糖/壳聚糖纳米药物控释体系,收率分别为75.33%,79%,79.67%,蛋白装载率为29.3%,24.7%,22.2%。通过红外光谱对比检测到羧甲基化壳聚糖为外包被存在。扫描电镜显示载体大小均一,在10-100um之间,可悬浮在水溶液中。体外崩解试验表明,样品在溶液中无明显暴释现象,6小时内蛋白释放率分别为57.1%,71.6%,70%,载体与酶之间通过共价键结合紧密,蛋白持续释放时间达24小时。体外崩解试验表明了衍生化壳聚糖/壳聚糖最佳比例为1:3,最佳交联剂浓度0.4%,通过调节衍生化壳聚糖/壳聚糖的比例,可有效调节载体崩解时间,达到控释作用。 通过对载体酶物理和化学性质的研究,发现反相微乳化法固定胰蛋白酶,稳定性和耐受性都明显增加,固定化酶与底物结合能力无明显变化, 米氏常数测定酶活性试验得出,羧甲基化壳聚糖/壳聚糖载体的Km =4.20x10-3mol/L,硫酸基化壳聚糖/壳聚糖载体的Km =3.87x10-3mol/L。羟乙基化壳聚糖/壳聚糖载体的米氏常数Km =3.92x10-3mol/L,相比于原酶的Km =3.40x10-3mol/L,固定化酶的与 WP=5 底物结合能力无明显变化. 固定化胰蛋白酶热稳定性远高于原酶,80°C缓冲液中,衍生化壳聚糖/壳聚糖固定化酶在100分钟内都具有较强活性。固定化胰蛋白酶分子对pH 变化的耐受性明显增强,最适pH为8.0,在pH=6.0-9.0的范围内都保持了较高的催化活性, 载体固定化酶对变性剂耐受性增强,经过80%乙醇处理10min,均无明显活性变化。 细胞培养试验未出现明显污染现象,证明制备载体的方法,符合用于细胞培养的无菌条件,固定化酶可以用于细胞培养中代替胰酶的作用,作用3分钟内细胞迅速脱落,与原酶近似,通过细胞计数比较,加入载体的HELA细胞生长正常,细胞状态良好,载体对HeLa 细胞增殖无任何不良影响。由生长曲线可以看出处理后的细胞继代后生长繁殖正常,说明固定化酶无明显的细胞毒性。
【学位授予单位】:东北师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:O636

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