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一种大豆LEA3蛋白(PM2)及耐盐结构域可提高大肠杆菌和烟草植株耐盐性

刘昀  
【摘要】:LEA(late embroygenesis abundant)蛋白是在植物发育晚期种子中大量积累的一类蛋白质。此外,在受干旱、盐、低温胁迫的植物营养组织中,这种蛋白质也可被诱导表达。因此,LEA 蛋白是与植物细胞抗逆保护作用密切相关的蛋白。 根据 LEA 蛋白序列的保守性和结构可将其分为七组。目前对第三组 LEA 蛋白(LEA3)的研究已积累了较多的资料,关于 LEA3 蛋白的结构与耐盐功能的研究引起人们越来越多的关注。 据报道,lea3 基因在转基因酵母、转基因水稻和小麦等植物中的表达可提高酵母或植物的抗旱耐盐性。LEA3 蛋白序列中通常有保守的 11-mer 氨基酸序列。人们推测,这种 11-mer 氨基酸序列可形成两亲性的 α-螺旋结构,通过其亲水表面结合胞内的水分子和过量的离子,从而降低由于细胞脱水及细胞内高离子浓度造成的毒害。 大豆 PM2 基因属 lea3 基因。经研究我们发现,大豆 PM2 蛋白序列中除含有 11-mer氨基酸重复序列外,还具有 6 个拷贝的 22-mer 氨基酸序列。经在基因数据库搜索,在其它的一些胚胎蛋白和 LEA 蛋白中也存在 22-mer 氨基酸序列。22-mer 氨基酸序列分布的广泛性和高保守性暗示它在种子发育过程中有着重要生理功能。但是关于此段序列的功能未见任何报道。 我们从开花 30~45d 的大豆“白农 6 号”未成熟种子的 cDNA 中扩增出 PM2 全长基因序列,它可编码 463 个氨基酸的多肽。将该基因克隆至 pET28a 大肠杆菌表达载体后,转化至大肠杆菌 BL21 Star 获得 BL/PM2 菌株。根据 PM2 蛋白的结构,我们还构建了 PM2 蛋白系列缺失克隆,即 BL/PM2A(第 1-262 氨基酸序列)、BL/PM2B(129-262氨基酸序列,由 6 个重复的 22-mer 氨基酸序列组成)和 BL/PM2C 菌株(268 个氨基酸,由 12 个重复的 22-mer 氨基酸序列组成)。SDS-PAGE 电泳和质谱分析表明,多肽 PM2、PM2A、PM2B 和 PM2C 在大肠杆菌中可被大量的诱导表达,蛋白质分子量分别为54.46kDa、34.70 kDa、21.83kDa 和 38.14kDa。这些蛋白均以可溶蛋白的形式存在于大肠杆菌胞质中,且多肽均具有良好的热稳定特性。 将构建的缺失克隆接种至高盐培养基上,检验它们所表达的多肽是否具有耐盐功能。结果表明,与对照 BL/pET28 菌株(含 pET28a 空载体)相比,表达 PM2 蛋白的BL/PM2 菌株耐盐性(700mM NaCl 和 700mM KCl)明显提高,而对 1100mM 山梨糖引起的渗透胁迫未显示出高的抗性。进一步比较缺失克隆在高盐培养基上的存活率,证明在 700mM NaCl 和 700mM KCl 胁迫条件下,BL/PM2 菌株的存活率高出对照 BL/pET28菌株的 1~2 倍;缺失克隆 BL/PM2A 和 BL/PM2B 菌株的存活率与 BL/PM2 菌株接近;而 BL/PM2C 菌株的存活率为 BL/PM2 菌株和 BL/PM2B 菌株的 2~3 倍。上述实验结果表明,PM2 蛋白和 22-mer 可提高大肠杆菌的耐盐功能,而且 22-mer 氨基酸序列表现出耐盐结构域的功能。 为进一步研究 PM2、PM2A、PM2B 和 PM2C 基因表达的多肽是否在高等植物中具有耐盐功能,我们将上述核苷酸序列克隆至含 CaMV 35S 启动子控制的 pBI121 植物表达载体。并利用农杆菌介导法转化烟草。提取转基因烟草叶片的 DNA 进行 PCR 扩增分析,表明 PM2、PM2A、PM2B 和 PM2C 基因已经分别整合至转基因烟草的基因组 DNA中。转化率分别为 44.4%、75%、62.5% 和 33.3%。将转基因烟草和对照烟草(转化空载体)接种在含 1.5% NaCl 的培养中培养 30d 后,转 PM2、PM2A、PM2B 和 PM2C 基因的烟草植株的叶色较绿,植株长出的新叶较多,而转化空载体的对照烟草植株则有较多叶片变黄,而且长出的新叶较少。而且,通过测定植株叶片的叶绿素含量发现,转基因烟草的叶绿素含量明显高于对照烟草。这些结果表明转化 PM2、PM2A、PM2B 和 PM2C基因的烟草植株的耐盐性均高于转化 pBI121 空载体的对照植株。PM2、PM2A、PM2B和 PM2C 基因的表达不仅可赋予大肠杆菌耐盐能力,而且可提高转基因烟草植株的耐盐性。尽管原核生物和真核生物存在很大差异,但这些基因的表达对原核和真核细胞的保护机制可能是相似的。


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