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降解PHBV菌株的选育及其酶学性质的研究

赵明明  
【摘要】:β-羟基丁酸与β-羟基戊酸的共聚酯(PHBV)是某些细菌在非平衡生长阶段体内碳源和能源的贮藏物质,它作为一种新型的可生物降解材料,继聚β-羟基丁酸酯(PHB)后越来越引起人们的关注。 PHBV 的降解依赖于许多细菌和真菌分泌的一种胞外酶,它能水解聚合物生成水溶性的产物。本论文工作的主要目的是通过紫外诱变筛选出能高效降解 PHBV 的突变菌株,分离纯化 PHBV 解聚酶,并对 PHBV 解聚酶的酶学性质进行比较研究。主要结果如下: 1. 以青霉(Penicillium sp.)DS9702-D10 为出发菌株,通过紫外线诱变分生孢子,采用透明圈初筛和摇瓶培养复筛的方法获得 5 株能稳定遗传的分泌 PHBV 解聚酶的高产菌株,其中 06 PHBV 解聚酶的酶活是原始菌株 PHBV 的 5.6 倍,H2 PHBV 解聚酶是原始菌株的 5.38 倍。 2. 测定 5 株突变株每日 PHBV 解聚酶酶活和蛋白含量,其中 11、19 突变株的酶活最高峰出现在 72h,H2 突变株出现在 96h,05、06 突变株出现在 120h。11、19、H2、05和 06 突变株 PHBV 解聚酶酶活分别是原始菌株 PHBV 解聚酶的 2.75、1.55、5.38、4.37和 5.6 倍。 3. 对原始菌株、06 突变株和 H2 突变株的 PHBV 解聚酶粗酶液的基本性质进行了对照研究。06 突变株和 H2 突变株的 PHBV 解聚酶粗酶液为 40℃和 50℃,分别相对于原始菌株 PHBV 解聚酶粗酶液最适反应温度提高了 20℃和 10℃,06 突变株 PHBV 解聚酶粗酶液在 40℃~60℃范围内稳定,H2 突变株 PHBV 解聚酶粗酶液在 30℃~60℃稳定,较原始菌株 PHBV 解聚酶粗酶液的温度稳定范围有所提高。原始菌株 PHBV 解聚酶粗酶液的最适 pH 值为 7.0,经紫外诱变所产生的 06 突变株 PHBV 解聚酶粗酶液最适 pH 值为 7.38;H2 突变株 PHBV 解聚酶粗酶液的最适 pH 值为 6.98 和 8.04 两个峰,酶活在此条件下较原始菌株 PHBV 解聚酶的酶活力有所提高。 4. 06 突变株 PHBV 解聚酶纯化倍数为 33.81,酶活回收率为 13.57%,酶蛋白相对分子质量为 28KD,最适反应温度为 60℃,最适反应 pH 值为 7.38,在 40℃~50℃,pH 为6.98~7.15 范围内较稳定;H2 突变株 PHBV 解聚酶纯化倍数为 39.28,酶活回收率为3.27%,酶蛋白相对分子质量为 44KD,最适反应温度为 50℃,最适反应 pH 值为 8.04,在 40℃~50℃,pH 为 7.6~8.4 范围内较稳定。Na~+、Ca~(2+)对上述两种酶的影响较弱,而 Fe~(2+),Zn~(2+),,Cu~(2+)对两酶影响较大,使酶失活。质谱仪测得酶降解 PHBV 的产物均为单体,即 β-羟基丁酸。


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