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《东北师范大学》 2007年
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咔唑降解菌株的筛选及其邻裂双加氧酶的克隆与鉴定

杨美英  
【摘要】: 本研究从吉林化工厂污水排污口於泥、四平金士百啤酒厂污水排污口於泥、四平联合化工有限公司污水排污口於泥和江苏常州咔唑生产厂地表污染土四个样品中分离到12株可以在咔唑为唯一碳源和氮源的CNFMM选择固体平板上良好生长的革兰氏阴性细菌株。通过16S rDNA基因序列比对分析,12个菌株分别属于6个菌属。JH061、PJ062、JS061和JS062四个菌株属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.);JH051、PJ051、PJ052和LH051属于芽孢杆菌(Bacillus sp.);JH052属于金黄杆菌属(Chryseobacteriumsp.)、JH062属于黄色氢噬胞菌(Hydrogenophaga intermedia)、PJ053属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)和PJ061属于Pandoraea sp.。 研究了节杆菌PJ053菌株的最适生长条件以及进化关系。与大肠杆菌JM109相比生长速度稍慢,30℃和pH 7为PJ053菌株的最适培养条件。菌落较光滑,边缘整齐,呈明亮的黄色,菌落形状比较有规则,呈圆形,菌株呈短杆状。进化树表明节杆菌PJ053与四个未培养的细菌形成一簇,而与已知的节杆菌如Arthrobacter sp 14等的亲缘关系较远。 构建了PJ053菌株基因组文库并获得两株阳性克隆JM109(pUCW402)和JM109(pUCW331)。通过GenSCAN软件和BLAST分析发现,在插入pUCW402的外源片段(3359bp)中存在一个由933bp编码的2,3-二羟基联苯双加氧酶(23DHBD)基因,一个锚蛋白基因而且在DHBD基因的上游区域可能存在一个羟化酶。pUCW331质粒中插入片段的长度为3967bp,GenSCAN软件和BLAST分析表明有3,4-二羟苯乙酸-2,3-双加氧酶(HPCD)基因和5-羧甲基2-羟基粘康酸半醛脱氢酶基因存在于这一序列中,而且也有可能存在一个金属依赖的磷酸水解酶基因。 进化分析表明,来源于PJ053菌株的23DHBD没有与已知的23DHBD形成一簇而是形成一个独立的分支。Southern杂交进一步证实编码该酶的基因定位于节杆菌PJ053的基因组DNA上。本文首次报道在节杆菌PJ053中发现了2,3-二羟基联苯双加氧酶(23DHBD)基因。为了证实933bp(包括终止密码子TAG)编码的23DHBD基因和1098bp编码HPCD基因具备生物学功能,利用构建过表达载体pETW402和pETW331,研究了在重组菌株BL21(pETW402)和BL21 (pETW331) 23DHBD和HPCD的表达情况及酶活分析。邻苯二酚喷雾表明,两个菌株表达的酶都具备将邻苯二酚转化为黄色产物2-羟基粘康酸半醛的活性。与菌株JM109(pUCW402)、JM109(pUCW331)和PJ053相比,23DHBD和HPCD的表达水平分别在BL21(pETW402)和BL21 (pETW331)中最高。酶活分析表明,23DHBD不具有绝对专一性,对2,3-二羟基联苯的催化能力高于邻苯二酚。因此推测PJ053菌株对芳香族化合物降解过程中,23DHBD主要负责催化双环化合物的降解。 利用Ni-NTA agarose介质对BL21(pETW402)和BL21 (pETW331)两菌株表达的蛋白进行纯化,制备了多克隆抗体。Western-blot分析了基因工程菌株和野生菌PJ053菌体内表达23DHBD蛋白和HPCD蛋白的水平。结果表明,基因工程菌JM109 (pUCW402)和BL21(pETW402)菌体内表达的23DHBD蛋白要远高于PJ053野生型菌株;HPCD蛋白在不同菌株中的表达情况也表现出相同的结果。 本研究还利用鞘氨醇单胞菌KA1的CarB基因为模板设计引物,从鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)JS061和黄色氢噬胞菌属(Hydrogenophaga intermedia)JH062克隆到carB(2’-氨基联苯- 2,3-二醇- 1,2-双加氧酶)基因。底物显色法证实该基因编码的酶具备将2,3-二羟基联苯转化为2-羟基-6-氧-6-苯基已二烯酸的活性。序列比对分析表明,从JS061、JH062基因组DNA PCR得到的CarB基因序列与鞘氨醇单胞菌属KA1和GTIN11菌株的CarB基因序列完全相同,同源性为100%。蛋白表达进一步证实该基因表达的产物与假单胞菌CA10菌株的CarB基因表达产物完全相同,分别由CarBa和CarBb两个亚基构成,分子量分别为29KD和10KD。CarB基因的克隆将为今后咔唑降解基因簇的研究提供了有力的理论依据和技术基础。
【学位授予单位】:东北师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:X172

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