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《东北师范大学》 2008年
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黑盖木层孔菌多糖化学结构和生物活性研究

李霞  
【摘要】: 本论文主要通过生物发酵技术培养黑盖木层孔菌;确定最优培养基;并且从菌丝体和发酵液中提取、纯化得到水溶性多糖;研究多糖的化学结构及抗肿瘤和免疫活性,并探讨多糖的结构与生物活性之间的关系。 首先筛选了适宜黑盖木层孔菌菌丝体生长的碳源和氮源。最优碳源为可溶性淀粉,最优氮源为玉米面,菌丝的生长速度在有机氮源培养基上要明显优于无机氮源,确定蔗糖-玉米面为黑盖木层孔菌的最佳碳-氮源组合。并且,该菌种适宜液体发酵培养。 黑盖木层孔菌经发酵培养后,得到发酵菌丝体,确定菌丝体多糖的最优提取条件为:提取温度100℃,浸提4次,每次2小时,浸提比1:30,各因素影响的大小次序是:提取次数浸提比浸提时间。 分别从菌丝体和发酵液中分离得到水溶性粗多糖:菌丝体粗多糖PNW和胞外粗多糖PNM。GC分析粗多糖组成:PNW由甘露糖和葡萄糖构成,摩尔比为2.68:1.00;PNM由甘露糖、半乳糖和葡萄糖构成,摩尔比为2.02:1.00:3.21。 采用冻融分级、脱蛋白、离子交换层析和分子筛凝胶层析等方法,分别从PNW和PNM中纯化出多糖PNW1和PNM1。HPLC检验PNW1和PNM1均为单一峰,平均分子量分别为33 kDa和29 kDa。GC分析,PNW1和PNM1均为杂多糖,由葡萄糖、半乳糖、甘露糖及少量的阿拉伯糖和岩藻糖组成,其摩尔比分别为3.26:8.77:6.44:1.00:1.35和20.06:8.72:6.94:1.00:0.76。 采用部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化等化学分析方法及IR、GC、GC-MS、13C NMR等仪器分析方法对PNW1和PNM1进行结构分析。确定了PNW1和PNM1的结构重复单元。PNW1的基本结构为:1→6- Glc和1→6- Gal构成主链,从Glc和Gal的O-2连接侧链,侧链由1→6- Man短链和Ara、Fuc、Man的末端构成。PNM1的基本结构为:1→6- Glc和1→6-Gal构成主链, Glc的O-2连接侧链,侧链由1→6- Man短链和Ara、Fuc、Glc、Man的末端构成。 建立BALB/c小鼠体内S- 180实体瘤模型,进行体内抗肿瘤活性试验。经测定,菌丝体多糖和胞外多糖均能抑制小鼠体内移植性肿瘤S- 180的生长。并且,菌丝体多糖%的抗肿瘤活性优于胞外多糖。其中PNW1在400 mg/kg时抑瘤率最高,达到74.70%。在体外实验中,菌丝体多糖和胞外多糖对S- 180细胞没有的明显抑制作用。菌丝体多糖和胞外多糖均有免疫调节功能,能增加荷瘤小鼠的脾相关系数和胸腺相关系数,调节血清中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。多糖与脾淋巴细胞或巨噬细胞共培养后,表现出增强淋巴细胞的增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬作用,并且促进巨噬细胞分泌NO和TNF-α。推测,其抗肿瘤作用是通过调节宿主的免疫机能实现的,可能与巨噬细胞有关。 PNW1和PNM1的分子量相近,在30 kDa左右,均由葡萄糖、半乳糖、甘露糖及少量的阿拉伯糖和岩藻糖组成,各单糖的含量不同,结构也不同,但是他们的结构有共同的特点:主链是由1→6- Glc和1→6- Gal共同构成,由O-2连接侧链,侧链残基为1→6- Man短链。推测,分子量不高的带有O-2分支点的1→6真菌杂多糖具有抗肿瘤和免疫活性。比较两种多糖的活性,PNW1的抗肿瘤活性明显优于PNM1,免疫活性也优于PNM1,表明真菌多糖的抗肿瘤活性也与糖苷键的类型及其位置有关。
【学位授予单位】:东北师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R284

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【引证文献】
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