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《东北师范大学》 2010年
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香雪兰体外再生植株和杂种后代遗传、表观遗传多态性及花香成分分析

高翔  
【摘要】: 对香雪兰3个品种进行了种间杂交的初步研究,共尝试了3个组合,选取14个杂交子代使用AFLP分子标记技术进行杂种鉴定,根据条带统计结果、聚类分析及主成份分析发现,子代全部是3个香雪兰品种的杂交后代,而且大部分都属于偏母本类型的杂种,子代AFLP扩增结果出现了亲本都没有的DNA条带,说明种间杂交产生了遗传变异。 MSAP(Methylation Sensitive Amplified Polymorphism)技术检测了香雪兰亲本和杂交后代的甲基化水平,在荷白与荷粉杂交体系中用了16对引物,共产生了711条带,甲基化水平在14.09%-15.77%之间,荷粉与荷黄的杂交体系中,21对引物共扩增出619条带,甲基化水平为11.38%-12.75%,两者都是以内侧胞嘧啶全甲基化为主。进一步将MSAP数据分为甲基化敏感多态性(Methylation-Sensitive Polymorphism,MSP)和甲基化不敏感多态性(Methylation-Insensitive Polymorphism,MISP),与AFLP一样,对MSAP数据做了聚类和主成份分析,验证了杂种的真实性。 尽管亲本向杂种的DNA甲基化模式的遗传传递主要遵循孟德尔的遗传方式,香雪兰种间杂交仍然可以导致杂种一代发生不同程度的DNA甲基化变异,在荷白与荷粉的杂交后代中,变异率为0.84%,荷粉与荷黄的杂交后代的变异率更低,仅为0.16%,杂种后代与亲本相比,主要表现为甲基化程度的降低。 通过Mantel’s检测,分析了AFLP、MSP和MISP之间的相关性,发现MSP与MISP之间相关性极显著,在荷白和荷粉杂交体系中,AFLP与MSP和MISP之间具有相关性,但是不显著,在荷粉与荷黄的杂交体系中,则没有相关性。 以幼花序和花序轴做为外植体,根据所用激素不同,香雪兰既可以通过直接体细胞胚胎发生途径由周缘细胞直接再生,还可以经过胚性愈伤组织间接再生。在直接体细胞发生途径中,最佳的激素配比是IAA:6-BA=2:1mg/L,幼花序的再生率为84%,花序轴的再生率为100%。在间接体细胞发生途径中,激素比例为6-BA:2,4-D为5:1mg/L时,愈伤组织再生的效率最高,其中幼花序为92.4%,花序轴为100%。当胚性愈伤组织转移到含有2mg/L IAA和3mg/L 6-BA的MS培养基上后,可以分化成完整的植株。 AFLP和MSAP两种分子标记技术被用来检测再生植株的遗传和表观遗传稳定性,在直接体细胞再生途径中,20对引物在亲本和11个再生植株中共扩增出916条清晰条带,其中8条表现为多态性,比率为0.87%,在间接体细胞再生途径中,18对引物共扩增出1075条带,其中3条为多态性条带,比率为0.27%,与亲本相比,再生植株变异模式有两种,即再生植株新带的增加和亲本条带的消失。MSAP分析表明,组织培养可以导致CG和CNG两种模式的甲基化水平的变异,变异率在直接和间接途径中分别为1.1%和1.3%。 以幼花序为外植体,在N6培养基上可以诱导黄原间接体细胞胚胎发生途径,SDS-PAGE技术检测这一形态发生过程中的可溶性蛋白变化,发现6种多肽与体细胞胚发育有关,分子量为45,53,55kD的多肽存在于胚性愈伤组织、球形胚、和胚芽鞘时期,83kD的多肽则存在于后两个时期,即胚芽鞘期和真叶期胚中,37kD的多肽存在于胚性愈伤组织和球形胚期胚状体中,35kD的多肽存在所有的时期当中。 利用静态顶空的方法收集了6个香雪兰栽培品种及其中两个品种9个正反交F1代的花香成分,经过GC-MS分析后,共检测到43种花香成分,每个品种的花香成分在3-25个之间,主要成分都仅仅为2-4种,包括异戊二烯类物质和脂肪族衍生物,同时还有少量的含氮和含硫化合物。在所有的成分当中,沉香醇的含量最高,在亲本和子代的花香研究中发现,亲本主要花香成分可以稳定的遗传给后代,此外,研究还发现花瓣和雌蕊是香雪兰花香的主要释放部位。 基于S?rensen’s相似指数,进行了非度量多维测度分析,结果表明,被测品种可以分为两类,同时本论文还讨论了香雪兰花香在授粉中的作用,主要表现在吸引蝴蝶、娥类和蜜蜂等昆虫方面的作用。
【学位授予单位】:东北师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S682.29

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