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《长春师范大学》 2018年
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耐盐基因ScHAL1和ZmHKT转入大豆的研究

孙雪慧  
【摘要】:大豆,我国重要的粮食和油料作物,通过大豆所制的豆制品等在我国国民饮食中占有极大比重,也是很好油脂与蛋白的营养来源~([1])。由于我国农产品、粮食作物等耕作面积受到土壤盐碱化威胁,导致这些农产品、粮食作物生长发育不能正常进行,造成产量损失严重。目前,如何减少作物遭受盐碱的威胁,提高植物耐盐碱性已成为作物育种工作的首要任务之一。鉴于传统大豆育种培育耐盐碱种质资源匮乏,难以对产量及性状进行综合改良,并且难以提高大豆耐盐碱特性。目前,转基因技术发展迅猛并且趋于成熟,结合分子生物学不仅可以对植物遗传性状进行定向改良,而且会因此丰富了耐盐碱基因资源。通过基因工程中转基因技术与常规育种的有效集成,是有效地解决大豆育种困难并且增强大豆抗盐碱能力,增强并改善大豆育种的重要手段。本研究将酵母耐盐碱基因ScHAL1与玉米耐盐碱基因ZmHKT导入大豆栽培品种Bert中,结合分子检测获得阳性转基因植物ScHAL145株与ZmHKT 40株,经耐盐性鉴定(耐1.5%NaCl),筛选出耐盐性状较好的转HAL1大豆转基因新材料9份,转HKT大豆转基因新材料7份。为耐盐碱转基因大豆育种奠定了较好的基础。主要研究结果如下:本研究将酵母与玉米耐盐基因ScHAL1与ZmHKT分别构建到植物表达载体pCAMBIA3301与pCAMBIA3300上,获得植物表达载体pCAMBIA3301-HAL1与pCAMBIA3300-HKT。选用转化率稳定、体系完整的农杆菌转化法进行大豆遗传转化,选用转化效率较高且对农杆菌敏感的Bert大豆品种作为受体材料,将酵母HAL1基因与玉米HKT基因导入到大豆中。对阳性转基因植株进行Bar基因试纸条、PCR、RT-PCR、Southern杂交等分子方面的检测及耐盐性鉴定。实验共对5200个大豆子叶节外植体进行侵染,转化后的再生植株通过PCR与Southern分子检测后分别获得含有耐盐基因ScHAL1转基因阳性植株45株,耐盐基因ZmHKT转基因阳性植株40株。鉴定出耐盐(耐1.5%NaCl)性状较好的大豆转基因材料ScHAL1 9份,ZmHKT 7份。1.植物表达载体的构建。以HAL1基因两端序列为模版设计引物,引物两端加上Noc I和Best EII酶切位点,对目的片段HAL1基因进行PCR扩增。胶回收目的片段。提取pCAMBIA3301质粒,用Noc I和Best EII限制性内切酶酶切pCAMBIA3301质粒,用T4连接酶将HAL1片段连接到pCAMBIA3301载体上,构建植物表达载体pCAMBIA3301-HAL1。以HKT两端序列为模版设计引物,引物两端加上Bam HI和Sac I酶切位点,对目的片段HKT进行PCR扩增。胶回收目的片段。提取pCAMBIA3300质粒,用Bam HI和Sac I限制性内切酶酶切pCAMBIA3300质粒,用T4连接酶将HKT片段连接到pCAMBIA3300载体上,构建植物表达载体pCAMBIA3300-HKT。选用冻融法导入,取构建好的载体pCAMBIA3301-HAL1与pCAMBIA3300-HKT导入到EHA105农杆菌中,保存以备用来进行大豆遗传转化试验。2.大豆的遗传转化。本研究选用农杆菌介导转化大豆的方法,将ScHAL1基因与ZmHKT基因导入到大豆Bert中。本研究侵染大豆子叶节外植体5200粒,芽的诱导率为91%,芽伸长率为27%,生根率为80%,转化率为2.5%。获得HAL1转基因植株45株,HKT转基因植株40株。3.转基因植株分子检测。分别以ScHAL1基因与ZmHKT基因设计引物并对转化得到的大豆植株进行PCR、RT-PCR、Southern等生化分子的鉴定及Bar蛋白试纸条快速鉴定,证明ScHAL1与ZmHKT基因通过遗传转转化方法已成功在大豆的基因组中整合并表达。4.芽期和苗期耐盐性鉴定。分子检测后对成功转入ScHAL1基因与ZmHKT基因的阳性转基因植株进行芽期和苗期耐盐性鉴定。通过阳性植株与非转基因植株对盐水浇灌(1.5%NaCl)的耐受性对比,鉴定出耐盐性良好的转基因植株。
【学位授予单位】:长春师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q943.2;S565.1

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