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甜菜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的克隆及其遗传转化

郝慧  
【摘要】:甜菜是我国糖料作物之一,在我国北方地区种植,在育种过程中,主要的目的是培育出高产、高糖、高品质的新品种甜菜。在甜菜的生产中病虫害较多,从而影响到甜菜的质量和品质。为了使植物生长性状得到改变,基因工程是最直接有效的手段。由于基因工程具有周期短,见效快等优点,所以,基因工程在植物新品种选育中是一条有效的途径。 由于建立甜菜植株再生体系比较困难,较低的遗传转化效率,具有较差的重复性。因此,甜菜植株再生体系及遗传转化体系的建立,转化并培育出优质、高产的甜菜新品种是许多研究者的目标,具有很大意义。 本研究是通过RT-PCR扩增技术,将甜菜的蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因克隆出来,进行重组质粒的构建,将目的基因利用农杆菌介导法导入甜菜,转化条件得到了优化,建立了稳定的甜菜叶柄遗传转化体系,获得转蔗糖磷酸合成酶基因的甜菜再生植株。主要研究结果如下: 1.对SPS基因进行扩增 利用RT-PCR方法从甜菜嫩叶片总RNA中克隆出甜菜的SPS基因。进行测定序列,该序列与甜菜SPS基因编码区的核苷酸序列其同源性可达100%。 2.构建植物表达载体 利用pMD18-TVector克隆载体的介导,将SPS基因与质粒pBI121连接,构建了以CaMV35S为启动子和Tnos为终止子的植物双元表达载体,该载体含有选择标记基因nptII。 3.农杆菌介导法优化了甜菜叶柄遗传转化体系 结果显示:将生长到对数生长期的农杆菌菌液重悬稀释,确定了浓度OD600值为0.6;叶柄外植体经过48h的预培养,确定侵染时间为5min;确定了共培养培养基中乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L;确定了22℃~25℃共培养4d;经过头孢霉素的抑菌,确定了200mg/L的Kan浓度的筛选。 4.对获得的阳性植株检测 用农杆菌介导法将SPS基因转入甜菜,经过筛选培养共获得27株抗Kan的甜菜稳定再生植株。提取27株基因组DNA,经PCR检测有8株呈阳性植株,PCR阳性率为29%。


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