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生物酶法制备真菌菌丝体多糖的工艺优化及生物活性研究

马丽雅  
【摘要】: 本文将9种酶提取真姬菇、齿耳菌和乳牛肝菌菌丝体多糖的效果进行了比较;并首次利用均匀设计优化了真姬菇菌丝体多糖的提取条件;对获得的真姬菇、齿耳菌菌丝体多糖进行了抗肿瘤和抗氧化活性的检测;同时比较了真姬菇胞壁多糖和胞内多糖的生物活性。 溶壁酶是提取3种真菌菌丝体多糖产量最高的酶类,其多糖产量分别是14.78±0.22 mg/g干菌丝、16.66±1.60 mg/g干菌丝、27.49±1.89 mg/g干菌丝,比对照提高了164.36%、156.68%、141.19%。在真姬菇和乳牛肝菌菌丝体多糖的提取中,中性蛋白酶A是最经济适合的酶类,其多糖产量分别为8.52±0.27 mg/g干菌丝、20.67±1.86 mg/g干菌丝,比对照提高了56.48%、44.85%;而在齿耳菌菌丝体多糖的提取中,中性蛋白酶A的多糖产量是7.39±0.16 mg/g干菌丝,比对照提高了13.86%,但与对照产量无差异显著性(p0.05)。 通过单因素实验获得了中性蛋白酶A酶解制备真姬菇菌丝体多糖的适宜酶用量、酶解时间、酶解温度、提取时间、提取温度和提取次数;采用均匀设计方法获得了中性蛋白酶A制备菌丝体多糖的最佳条件为:在2%酶用量下,43.05℃酶解4h,100℃提取1h,提取1次。该优化条件下多糖产量的预测值为16.65 mg/g干菌丝,验证实测值为15.73±0.15 mg/g干菌丝,优化条件下获得的多糖产量比优化前的产量提高75.0%,比热水提取法和微波辅助提取法分别提高122.5%和104.8%,表明酶解法是简便易行的高产制备真姬菇菌丝体多糖的方法。 利用MTT法检测了真姬菇菌丝体多糖的抗肿瘤活性。果胶酶、酸性蛋白酶、纤维素酶A提取的菌丝体多糖对癌细胞(SGC7901)的抑制率显著高于其它酶及对照提取的多糖(p0.05),其IC50分别是0.343 mg/mL、0.397 mg/mL、0.430 mg/mL。中性蛋白酶A提取的多糖的抗肿瘤活性的IC50是0.984 mg/mL。真姬菇胞壁多糖和胞内多糖的抗肿瘤活性试验表明,发挥抗肿瘤作用的多糖主要位于菌丝体胞内。 不同酶类提取的齿耳菌菌丝体多糖的抗肿瘤活性试验表明,纤维素酶B提取的多糖的活性显著高于其他酶类提取的多糖(p0.05),其抗肿瘤活性的IC50为0.863 mg/mL。 抗氧化活性试验中,木瓜蛋白酶、果胶酶、中性蛋白酶A和B提取的真姬菇菌丝体多糖的抗氧化活性较高,他们的羟基自由基清除能力的EC50分别是51.98μg/mL、55.76μg/mL、63.56μg/mL、62.49μg/mL;超氧阴离子自由基清除能力的EC50分别是153.77μg/mL、195.61μg/mL、252.68μg/mL、219.85μg/mL。酶类对真姬菇胞壁多糖的抗氧化活性无影响。多糖的抗氧化活性成分主要存在于菌丝体胞内。 木瓜蛋白酶提取的齿耳菌菌丝体多糖的总抗氧化能力,清除羟基自由基能力,超氧阴离子自由基清除能力均比其他酶提取的多糖高(p0.05),其羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力的EC50分别是59.42μg/mL、74.78μg/mL。


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