L-半胱氨酸对细菌产氢过程的促进作用

【摘要】：有机废水发酵法生物制氢技术以其环境友好并产生清洁能源的特点,逐渐成为环境生物技术领域的研究热点之一。近年来,随着不同种属的产氢细菌被分离纯化、不同形式的制氢反应器被研发、产氢细菌的培养条件得到优化以及分子生物学技术的引入,发酵法生物制氢技术理论逐渐得到发展完善。生产性示范工程的调试和运行更是为生物制氢技术的推广应用打下基础。然而如何提高产氢效率、降低生产成本、稳定运行反应器仍是该技术工业化得到应用需要解决的问题。一直以来,研究人员尝试采用各种方法提高产氢效率。本研究选择L-半胱氨酸作为产氢促进剂,一方面因为L-半胱氨酸是一种良好的还原剂;另一方面L-半胱氨酸具有巯基,而巯基是氢化酶的官能团之一。因此,研究L-半胱氨酸促进产氢细菌的生长、产气、代谢以及作用机制,对于提高细菌的产氢能力有重要的意义,对于研究其它提高产氢速率的方法具有借鉴作用,同时对于深化产氢理论有一定的参考价值。 针对L-半胱氨酸对于产氢细菌的影响,本文从细菌纯培养、混合培养等角度进行研究,通过分批培养、连续流培养等手段考察L-半胱氨酸对细菌产氢效能的促进作用。同时利用Real-Time PCR技术,实现了氢化酶表达的定量检测,更加准确的描述了L-半胱氨酸的促氢作用机制,也为其他产氢细菌靶基因的定量表达方法提供参考。 选择乙醇型发酵中优势种群的模式菌株产乙醇杆菌YUAN-3进行考察,优化了YUAN-3的生长条件,在含有缓冲体系的培养基初始pH为6.0时,YUAN-3的平均产氢速率和比产氢率都达到最大,分别为5.75 mmolH_2/g-CDW·h和2.32 molH_2/mol-葡萄糖。在初始pH 7.0时,细胞干重达到最大,为0.59g/L-培养基。 对于产氢细菌YUAN-3的分批培养显示适量添加L-半胱氨酸可以促进发酵细菌的生长和产氢,并提高底物利用能力。细胞干重随着L-半胱氨酸浓度的增加而增加,当L-半胱氨酸浓度为1.5g/L时,生物量达到最大为0.53g/L-培养基,产生的氢气量在L-半胱氨酸为0.8g/L时达到最大值为1995 mL/L-培养基。实测数值和用matlab模拟修正的Gompertz方程证明了L-半胱氨酸的添加加速了YUAN-3的产气过程。 L-半胱氨酸的流加迅速降低了反应器内部的ORP,促进了乙醇型发酵的形成,提高了产氢速率、生物量,并提高了微生物产氢活性。流加L-半胱氨酸的反应器在14d后开始形成逐渐典型的代谢产物,此后其优势越来越明显。未流加L-半胱氨酸反应器在启动20d以后才形成以乙酸、乙醇为主要代谢产物的乙醇型发酵。在启动的第1d,流加L-半胱氨酸的反应器的ORP就立即下降到-400mv左右,而未流加L-半胱氨酸的反应器内的ORP下降至此需要10d以上。在启动结束时,未流加和流加L-半胱氨酸的反应器平均产氢速率分别为2.74 L/d和2.81 L/d,生物量分别为为9.5g/L和10.1g/L。 从细胞水平和分子水平分别考察L-半胱氨酸促进产氢作用机制。结果表明,L-半胱氨酸在促进YUAN-3产氢过程中促进了碳源的利用,并发挥了还原剂的作用,同时还促进了YUAN-3的凝集能力,但L-半胱氨酸不能缓解产物的反馈抑制。用特异引物对氢化酶表达进行定量分析,扩增结果表明,添加L-半胱氨酸后,氢化酶基因表达增强,在L-半胱氨酸的浓度为0.8 g/L-培养基时,氢化酶基因表达可达2.72×10~7拷贝数/μL。L-半胱氨酸的添加使等蛋白情况下乙醇脱氢酶的活性减弱,但由于生物量的增加和单位生物量产生蛋白质浓度的增加,添加L-半胱氨酸后乙醇的产量仍逐渐增加。综上分析,L-半胱氨酸促进产氢的机制是氢化酶表达增加与细菌生物量增加共同作用的结果。