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《哈尔滨工业大学》 2011年
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抑制宋内志贺菌益生菌株的筛选及作用机制研究

张英春  
【摘要】:应用益生菌制剂防治致病菌感染,具有安全和减少耐药性等优点,为控制致病菌感染性疾病提供了新的途径。中国是一个乳酸菌资源十分丰富的国家,为乳酸菌的研究和开发利用提供了很好的平台。本论文采用了有效的筛选路线,筛选出对肠道致病(S. sonnei)有特异性抑制作用的益生菌菌株,并对其抑制S. sonnei的机制进行了探讨。 以传统食品和粪便中分离的197株目标菌株为资源,以LGG为参考菌株,采用琼脂扩散法初步筛选出了53株对致病菌S. sonnei、E. coli和S. Typhimurium有不同的抑制作用的菌株,结果发现不同来源的菌株对致病菌的抑制性不同,其中23株乳酸菌对S. sonnei具有较强的抑制性。同时以HT-29细胞为模型,评价了53株初筛菌株的粘附特性,筛选出了具有粘附性的25株乳酸菌,即黏附指数大于50个细菌/100cells。结合这两个指标,共筛选出13株乳酸杆菌(M5-L、J10-L、J21-L、Q8-L、X12-L、Q6-L、G15-L、F0421、IN3432、IN3821、IN4025、IN4024、IN3623)作为初筛菌株,并研究了它们对模拟胃肠道环境的耐受性,结果发现不同来源的菌株对胃液的耐受性不同,采用Biolog微生物鉴定系统对初筛菌株进行了鉴定。 通过对13株乳酸杆菌和LGG发酵18 h产生的抑菌化合物分析,发现乳酸杆菌的发酵上清液(CFCS)经过蛋白酶K处理、热处理后并不影响其抑菌活性,而将CFCS的pH调整为6.5后,其抑菌活性消失。初步判断乳酸杆菌产生的主要抑菌物质是有机酸类物质,而不是抗菌肽类物质。通过进一步研究乳酸杆菌的CFCS和CFCS-pH 6.5对S. sonnei的生长影响时发现,乳酸杆菌产生的有机酸对S. sonnei具有杀伤作用,2 h后S. sonnei的活菌数下降了2.7-3.9个log值,而3 h后,大多数乳酸杆菌的CFCS中检测不到S. sonnei的活菌数。而在CFCS-pH6.5培养过程中,S. sonnei的生长没有受到影响,与对照组的生长趋势接近一致,说明其它的抑菌物质没有发挥作用,进一步证明了乳酸杆菌产生的抑菌化合物主要是有机酸。通过HPLC分析有机酸发现,乳酸杆菌产生的乳酸含量在183-293 mmol/L之间。 以HT-29细胞为模型,研究了13株乳酸杆菌对S. sonnei排除、竞争和取代黏附作用。从中有效筛选出4株具有显著抑制S. sonnei黏附作用的菌株M5-L、J10-L、Q8-L和F0421。其中的M5-L和F0421在三种作用方式中具有显著抑制S. sonnei的黏附作用。对M5-L、J10-L、Q8-L和F0421进行氯化锂、高碘酸钠和热处理后,进行抑制S. sonnei的黏附作用,发现经过氯化锂处理后,抑制黏附能力显著下降,确定乳酸杆菌中S-层蛋白与S. sonnei竞争黏附位点是其抑制S. sonnei黏附的主要作用机制。SDS-PAGE分析M5-L、J10-L、Q8-L和F0421中提取的S-层蛋白,证明了S-层蛋白的存在,其中M5-L、J10-L和Q8-L中的主要S-层蛋白分子量为45 kDa左右,而F0421的主要S-层蛋白分子量为40 kDa左右。通过对S-层蛋白中的氨基酸组成分析发现,其中含有大量的疏水性氨基酸,其含量分别为40.52%、43.80%、41.45%和35.40%。考虑到M5-L和F0421在排除、竞争和取代S. sonnei黏附作用的效果都比较显著,所以选择M5-L和F0421这2株菌做进一步实验。 最后研究了F0421和M5-L对S. sonnei引起上皮细胞屏障功能破坏的防护作用。免疫组化结果显示,F0421能够阻止S. sonnei引起的ZO-1和occludin蛋白表达量的减少,而M5-L能够阻止S. sonnei引起的occludin蛋白表达量的减少,表明其对S. sonnei引起的上皮细胞屏障功能损伤具有防护作用。通过ELISA测定各个处理组细胞上清液中IL-8和IL-10的含量变化,表明乳酸杆菌F0421和M5-L主要是通过抑制S. sonnei刺激HT-29细胞产生IL-8来保护上皮细胞免于损伤的,而对于IL-10产生的影响不显著。经过16SrDNA进一步鉴定,M5-L为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp paracasei),F0421为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)。
【学位授予单位】:哈尔滨工业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R371

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