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《哈尔滨工业大学》 2013年
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基于纳米探针技术的NSCLC细胞表面形貌和力学特性研究

栗亚  
【摘要】:癌症以其高发病率和致死率已经成为人类面临的重要公共卫生问题,由于癌细胞具有隐蔽性强、无限增殖、侵袭和转移的生物学特性,准确的进行癌症的早期诊断对及时开展治疗最为关键。目前确诊癌症的组织病理学方法需要制备切片,不仅制片过程繁复、成本高、使细胞丧失生理结构,而且诸多因素会影响切片的正确判断,如肿瘤细胞分化程度、细胞的异质性、非特异性染色等,并且这些方法仅限于定性和半定量阶段。如何进行癌症的有效早期诊断已经成为亟待解决的难题,尤其是定量诊断和预报癌变是当前追求的目标。 原子力显微镜(AFM)除了能以纳米级别的分辨率在液相中检测活细胞表面的超微形貌,也能通过对细胞施加微弱的作用力获得细胞的力学特性,进而获取细胞内部结构变化和细胞的功能状态信息。尽管AFM已经检测了包括鱼角膜细胞、肿瘤细胞、干细胞等多种细胞的粘弹性,但是其弹性模量值从100Pa-100kPa不等,如此大的差异并非都归因于细胞亚结构的区别,还受到检测条件、方法和模型等方面的影响。因此本文根据准确分析非小细胞肺癌(NSCLC)细胞力学特性的需要,旨在从表面成像参数设定、检测条件、模型选择等角度,提出准确可行的细胞力学特性的评价方法,并据此分析NSCLC细胞力学特性、内部细胞骨架结构及其转移潜能的关系。这也是首次对不同恶性程度的NSCLC细胞力学特性和骨架结构的对比分析。具体研究内容主要包括以下几个方面: 提出了优化细胞AFM成像质量的方法,为细胞的力学特性检测奠定基础。利用二次回归正交旋转设计,模拟出了以细胞扫描图像的清晰度为因变量,AFM扫描电压、扫描频率和比例增益为自变量的数学模型,并计算出理论上在扫描电压为0.61V,扫描频率为2.23Hz,比例增益为3.85的条件下,扫描得到的细胞图像最优。以此最佳扫描条件获得了不同恶性程度NSCLC细胞的形貌图,可以较清晰的观察细胞的表面结构,如伪足、分泌颗粒、细胞骨架纤维、细胞间连接甚至核仁等,不同恶性程度的NSCLC细胞的骨架纤维分布存在较大差异。 分析多种检测因素对NSCLC细胞弹性模量(E)的影响,提出了肺癌细胞力学特性的准确评价方法,应采用球形针尖以避免锥形针尖对细胞弹性的高估;对于细胞中心和边缘区域的力学检测应分别以半无限和有限厚度的Hertz模型进行准确计算;检测温度应为近细胞生理环境的37℃,细胞形态对细胞弹性无明显影响;应以低于1Hz的加载速率而避免细胞粘性对检测结果的影响。该评价方法为准确检测癌细胞的粘弹性提供了技术保障。 提出了以细胞的外部力学特性鉴定肺癌细胞恶性程度的新方法,提供了细胞癌变鉴别的新手段。以三种NSCLC细胞为研究对象,发现恶性程度不同的三种细胞弹性模量关系为:E低恶性E中恶性E高恶性。基于AFM的应力衰减实验研究了不同恶性程度的NSCLC的粘性特征,高转移性的大细胞肺癌NCI-H1299与低转移性的A549细胞相比,NCI-H1299细胞的松弛模量ER低26%、Kelvin弹簧常数K1低26%,表观粘性系数μ低23%。证明了肺癌细胞的顺应性和其侵袭性呈正相关,细胞粘弹性的减小使细胞变得更柔软,更有利于转移性癌细胞从原发灶释放、穿过毛细血管的内皮间隙进行内渗和外渗,转移至区域淋巴结甚至远处器官等。 利用纳米原位力学检测系统研究了NSCLC细胞的弹性和粘性特征。以Oliver-Pharr方法进行计算,最终得到的细胞的弹性特征:ENCI-H1299ENCI-H520。观察到了癌细胞在恒力状态下的蠕变现象,将蠕变数据与Voigt模型、Maxwell模型和Kelvin模型进行非线性拟合后,利用Kelvin模型计算两种细胞系的蠕变参数,发现高转移性的大细胞肺癌NCI-H1299的蠕变参数E1、E2、η1和η2明显小于低转移性肺鳞癌细胞NCI-H520(P0.05)。以细胞骨架图像为研究对象,利用数盒子法计算二值图像的分形维数,发现分形维数可以评价细胞骨架纹理的复杂性特征,可以作为细胞骨架图像定量描述的指标,由此提出了以细胞骨架纤维的分形维数来鉴别癌细胞的辅助方法。由此最终建立了细胞内部骨架结构-细胞外部力学特性-细胞癌变的定量联系。
【学位授予单位】:哈尔滨工业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R73-3

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