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保加利亚乳杆菌细胞内甜菜碱的转运及其调控蛋白初探

王海娟  
【摘要】:保加利亚乳杆菌是酸乳重要的菌种之一,但其活菌数是目前研究的瓶颈,在高密度培养中很难达到高的活菌数,这与其培养及生长过程中所处的环境有关。保加利亚乳杆菌在高密度培养过程中往往通过流加碱液来消除酸的反馈抑制,而随之便会产生高盐应激问题,因此提出了相容性溶质的概念。甜菜碱便是相容性溶质的一种。甜菜碱对盐胁迫下菌体具有渗透保护作用,然而目前对于保加利亚乳杆菌如何转运甜菜碱,甜菜碱如何起到渗透保护作用的研究报道还很少,因此本课题以保加利亚乳杆菌为研究对象,研究甜菜碱的转运,并对甜菜碱的调控蛋白进行初步研究。本文通过对保加利亚乳杆菌的耐盐性进行研究,确定其盐亚致死浓度为0.20mol/L。通过外源添加甜菜碱,确定保加利亚乳杆菌盐胁迫条件下甜菜碱转运的最佳菌体条件为,甜菜碱1.20mmol/L,初始培养p H为6.0,在37℃,培养24h。并用HPLC法测不同条件下的胞内甜菜碱浓度,得出单位菌体胞内甜菜碱含量达到1.01±0.04mg时对菌体的保护作用最大,并得出甜菜碱对盐胁迫下菌体具有渗透保护作用以及应对不利温度、p H的应激协同作用。利用SEM观察盐胁迫下加入甜菜碱的菌体形态,与对照相比菌体直径降低了12.31%,再次证明了甜菜碱的渗透保护作用。利用双向电泳对保加利亚乳杆菌细胞内甜菜碱的调控蛋白进行研究,首先确定菌体全蛋白的最佳提取条件为超声功率75W,超声时间10×10s。其次确定最佳除盐方式为Ready PrepTM 2-D Clean up Kit。最后通过对质谱鉴定成功的8个差异蛋白进行GO和kegg数据分析得出盐胁迫下甜菜碱的加入使得Gro L上调,其作为应激蛋白具有分子伴侣的作用,可以防止蛋白质折叠;与能量代谢相关的蛋白Gap A、Fba、Gap、Ldb0534上调,以便菌体启动甜菜碱的转运系统应对盐胁迫的不利环境;与氨基酸合成相关的蛋白Fba上调,以便有更多的相溶性溶质应对盐胁迫;通过string数据库分析延伸因子EF-G、EFTu下调,其可参与m RNA的翻译,负责肽链延伸。利用响应面设计的方法研究甜菜碱与其他外源因素对菌体的协同保护作用,结果表明促进盐胁迫菌体生长最佳组合为精氨酸3.40mmol/L、鸟氨酸2.60mmol/L、六偏磷酸钠2.27mmol/L,活菌数为(1.80±0.18)×108CFU/m L,与对照组相比提高了33.33%,并验证了模型具有97.15%的准确性。


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