电子自旋标记方法对天青蛋白特征分析

【摘要】：天青蛋白azurin是假单胞杆菌分泌的一种细胞蛋白，属于低分子量的蛋白，在生物体内起到氧化还原和电子传递的作用。以前的研究多局限于其分子构象，内部结构等方面。最近研究发现，azurin能够与肿瘤抑制蛋白p53相复合，形成的复合物对肿瘤细胞的凋亡起到促进作用。这一研究发现使人们对复合物产生兴趣，着手于研究二者复合之后的理化性质和作用机制以及其它方面。但是由于仪器条件所限，一直没有得到喜人的成果。 我们采用新的方法—电子顺磁共振方法对azurin进行内部构象的探索，用自旋标记物与天青蛋白进行特异性标记，在ESR波谱上通过标记物的旋转相关时间τ_c的变化来体现蛋白内部构象的变化。从而希望能够摸索出此仪器对蛋白内部研究独特的优越性，进而能够采用此仪器对azurin与p53形成的复合物进行作用机制的研究以及化学性质的探索。实验证明，在不同的溶剂相中，自旋标记的τ_c不同。在甘油梯度中，随着甘油梯度的增加，自旋标记物的τ_c也增加。温度降低，分子内部驰豫行为降低。在用盐酸胍变性的情况下，随着盐酸胍浓度的增加，旋转相关时间τ_c逐渐降低，可见蛋白内部的立体结构松散，构象已经松弛。用热变性得到的结论与此类似，在65℃～85℃范围内进行热变性，通过ESR的研究，发现其旋转相关时间τ_c随着温度的增加而降低，蛋白内部结构松散，铜离子脱离蛋白内部。通过以上的研究，发现采用电子自旋标记的方法检测蛋白内部结构在常规和异常情况下的微观变化十分直观，优于其他仪器，因此能够对复合蛋白进行复合机制的探索。