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《黑龙江八一农垦大学》 2017年
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猪伪狂犬病病毒HeN1株gE蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

吴桐  
【摘要】:伪狂犬病(Pseudorabies,PR),是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)所引起的多种家畜、野生动物感染的一种急性传染病。PRV属于疱疹病毒科(Herpesviridae),α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae),猪疱疹病毒Ι型(Suid herpesΙ)。gE基因是PRV的一个与毒力相关的增殖非必需基因,gE基因编码的糖蛋白E(gE)是非必需糖蛋白,缺失gE基因并不影响病毒粒子的复制、扩增以及免疫原性,但病毒粒子的毒力却大幅减弱,因此,gE糖蛋白可以作为区分疫苗免疫猪和野毒感染猪的标志蛋白。2011年以来,PR在我国猪场中呈暴发性流行,给我国养猪业造成了严重的经济损失,所以,建立快速有效的诊断检测方法势在必行。本研究以原核系统表达PRV HeN1株截短的gE(aa127~aa232)蛋白(rgE),并对表达的rgE进行纯化免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,以该病毒感染的Vero E6细胞及真核表达的gE蛋白为检测抗原,采用IFA检测方法筛选杂交瘤细胞系,获得一株稳定分泌抗PRV gE的MAb杂交瘤细胞系,将其命名为mgE185,并通过截短表达gE蛋白鉴定该MAb的抗原表位。mgE185 MAb亚型鉴定为IgG1型,轻链为Κ链。该MAb不具有中和病毒的活性,其细胞培养上清及腹水IFA效价分别为1:80和1:2 560。Western blot试验显示mgE185可以特异性识别gE蛋白,表明其针对的抗原表位为线性表位。通过截短表达gE蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为151IGDYL155,序列比对表明该抗原表位在PRV中高度保守且是首次发现,在以往的文献中未见报道。该序列与Jacobs鉴定的主要抗原表位区aa52~aa238相比更加短小、精确。综上所述,本研究制备的mgE185 MAb以及其抗原表位的确定为进一步研究PRV gE的抗原结构奠定了基础,为PR的诊断治疗以及疫苗的研制提供了理论与实践依据。
【关键词】:伪狂犬病病毒 gE蛋白 原核表达 单克隆抗体
【学位授予单位】:黑龙江八一农垦大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.651
【目录】:
  • 符号说明4-11
  • 摘要11-12
  • 英文摘要12-13
  • 1 文献综述13-26
  • 1.1 伪狂犬病13
  • 1.2 伪狂犬病毒生物学特性13-15
  • 1.2.1 病毒粒子结构13-14
  • 1.2.2 病毒基因组14-15
  • 1.3 囊膜糖蛋白15-18
  • 1.3.1 必需糖蛋白15-17
  • 1.3.2 非必需糖蛋白17-18
  • 1.4 gE糖蛋白的研究进展18-20
  • 1.4.1 gE糖蛋白的分子生物学特性18-19
  • 1.4.2 gE糖蛋白的抗原表位19
  • 1.4.3 gE糖蛋白的功能19-20
  • 1.4.4 gE糖蛋白在伪狂犬病根除计划中的意义20
  • 1.5 单克隆抗体的研究进展20-21
  • 1.5.1 单克隆抗体技术20-21
  • 1.5.2 单克隆抗体的特点21
  • 1.5.3 单克隆抗体的应用21
  • 1.6 伪狂犬病毒抗体的检测方法21-24
  • 1.6.1 中和试验21-22
  • 1.6.2 免疫沉淀试验22
  • 1.6.3 免疫荧光抗体技术22-23
  • 1.6.4 酶联免疫吸附试验23-24
  • 1.6.5 乳胶凝集试验24
  • 1.6.6 血凝抑制试验24
  • 1.6.7 免疫印迹24
  • 1.7 研究的目的及意义24-26
  • 2 材料与方法26-44
  • 2.1 实验材料26-29
  • 2.1.1 实验动物26
  • 2.1.2 病毒、菌株、细胞及质粒26
  • 2.1.3 主要试剂及试剂盒26-28
  • 2.1.4 主要仪器设备28-29
  • 2.2 试验方法29-44
  • 2.2.1 rgE的表达、纯化及鉴定29-30
  • 2.2.2 gE的真核表达30-31
  • 2.2.3 间接免疫荧光(IFA)检测方法的建立31
  • 2.2.4 BALB/c小鼠的免疫31-32
  • 2.2.5 杂交瘤细胞株的筛选32-34
  • 2.2.6 单克隆抗体腹水的制备34
  • 2.2.7 单克隆抗体特异性的鉴定34-35
  • 2.2.8 单克隆抗体效价的测定35-36
  • 2.2.9 单克隆抗体生物学特性的鉴定36-37
  • 2.2.10 抗原表位分析鉴定流程37-38
  • 2.2.11 抗原表位的初步鉴定38-41
  • 2.2.12 抗原表位的精确鉴定41-43
  • 2.2.13 抗原表位的序列比对43-44
  • 3 结果与分析44-54
  • 3.1 rgE的表达鉴定44
  • 3.2 IFA血清鉴定44-45
  • 3.3 细胞融合及阳性杂交瘤株的筛选45
  • 3.4 单克隆抗体特异性的鉴定45-46
  • 3.5 单克隆抗体效价的测定46-48
  • 3.5.1 杂交瘤细胞培养上清的效价测定46-47
  • 3.5.2 腹水的效价测定47-48
  • 3.6 单克隆抗体生物学特性的鉴定48-50
  • 3.6.1 杂交瘤细胞抗体分泌稳定性的鉴定48-49
  • 3.6.2 单克隆抗体Ig亚类的鉴定49
  • 3.6.3 单克隆抗体中和活性的测定49-50
  • 3.7 gE2基因片段的PCR扩增50
  • 3.8 重组质粒的PCR鉴定50-51
  • 3.9 单克隆抗体抗原区域的鉴定51-53
  • 3.9.1 抗原表位的初步鉴定51
  • 3.9.2 抗原表位的精确鉴定51-53
  • 3.10 单克隆抗体抗原表位的序列比对53-54
  • 4 讨论54-57
  • 5 结论57-58
  • 参考文献58-68
  • 附录 各种培养液及溶液的配制68-70
  • 致谢70-72
  • 个人简历72

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