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《黑龙江八一农垦大学》 2013年
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牛源大肠杆菌ERIC-PCR分型方法的建立及K99-987P-F41融合蛋白免疫效果评价

郎秀艳  
【摘要】:本试验采用大肠杆菌肠杆菌科基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)方法对从黑龙江省各养殖场分离的牛源大肠杆菌进行基因分析,建立基因分型方法。同时,扩增ETEC的三种菌毛K99、F41和987P基因,构建K99-987P-F41融合表达载体,以纯化的K99-987P-F41重组蛋白免疫小鼠,并对其免疫效果进行评价。查阅文献设计合成ERIC引物,通过反应条件优化,建立起ERIC-PCR检测犊牛腹泻大肠杆菌方法。应用该方法对临床分离的产肠毒素性大肠杆菌菌株进行基因分型。结果表明,ERIC-PCR检测临床分离的大肠杆菌可扩增出2~10条带,可以分为17个基因型,其中以D型菌株最多。根据GenBank上已发表的ETEC三种菌毛K99、987P、F41基因序列,设计合成引物,经PCR扩增,将三段目的基因融合亚克隆至大肠杆菌原核表达载体pET30a(+)。经鉴定的阳性质粒K99-987P-F41转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导融合表达60 Ku左右的蛋白,蛋白大小与理论值相符合。Western Blot检测结果表明,该蛋白具有良好的免疫活性。本试验利用常规方法制备大肠杆菌灭活全菌体、大肠杆菌重组菌毛K99、987P和F41混合蛋白、天然菌毛K99、987P和F41混合蛋白和大肠杆菌融合蛋白K99-987P-F41,免疫小鼠。免疫后采集血液、粪便及小肠冲洗液,利用间接ELISA检测血清IgG、IL-4和IFNγ,粪便及肠段冲洗液中SIgA。经MTT试验观察小鼠脾淋巴细胞增殖情况。另外,通过实验小鼠攻毒试验检测几组疫苗保护效果。结果表明,各组疫苗均能诱导小鼠产生抗体,免疫效果依次是灭活全菌体天然菌毛K99、987P和F41混合蛋白重组菌毛K99、987P和F41混合蛋白融合蛋白K99-987P-F41,但是组间差异不显著。淋巴增殖试验结果表明试验组可以产生明显的体液免疫。IL-4、IFNγ均有提高。SIgA效果不显著。本试验为研制亚单位疫苗,有效预防产肠毒素性大肠杆菌所引发的疾病,提供了理论基础。
【学位授予单位】:黑龙江八一农垦大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S852.61

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