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《东北农业大学》 2011年
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A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

康忠惠  
【摘要】:禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的以肿瘤发生和免疫抑制为特征的世界范围的禽类疾病。禽白血病病毒属于反转录病毒科,α反转录病毒属。感染鸡的禽白血病病毒可分为外源性的A、B、C、D、J亚群和内源性的E亚群。目前,世界各国控制禽白血病的主要方法是通过病原检测,淘汰阳性鸡,从而净化种群达到消灭本病的目的。因此,在该病的控制中及时准确的诊断就显得尤为重要。目前,基于核酸扩增的分子生物学诊断技术如PCR、实时荧光定量PCR等在病原微生物的检测以及疾病诊断方面发挥着重大作用,但这些方法要么需要精密仪器,要么要求操作人员具备较高的专业知识和操作技能,因此不利于在基层推广,无法满足简单、快速、准确诊断的要求。而传染病的防控和治疗的关键在于对病原微生物的快速、准确的检测并确诊。因此,建立一种快速、准确的新型诊断技术迫在眉睫。 本研究根据序列对比结果和禽白血病亚群间序列特征,针对gp85区段设计了两组分别用于检测A、B亚群禽白血病的LAMP引物。通过对反应条件的优化,使得A、B亚群的LAMP检测方法不与除本身亚群外的其它禽白血病主要亚群发生交叉反应,同时也不与其它常见的禽类传染病发生非特异性反应。ALV-A的LAMP方法敏感性试验表明:该方法能够在45分钟内检测出20个拷贝的病毒核酸,比常规PCR敏感100倍。ALV-B的LAMP方法敏感性试验表明:该方法在80min内能够检测出4000个拷贝的病毒核酸,与普通PCR敏感度相当。LAMP检测方法的建立实现了对A、B亚群的快速检测,而且可通过添加荧光染料FDR,使其反应前后颜色发生显著变化来进行判定,实现了反应产物的可视化。整个反应过程不需要开盖,极大地减少了污染的可能性,具有现地应用的前景。 综上所述,本研究成功建立了A、B亚群禽白血病的LAMP检测方法。为今后的相关研究奠定了理论基础。
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