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《东北农业大学》 2011年
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苏云金芽胞杆菌新型cry1基因克隆、表达及活性分析

刘东明  
【摘要】:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种世界上应用广泛的生防微生物,它具有高度的杀虫特异性和对人畜无害的优点。主要的杀虫成份是杀虫晶体蛋白,由cry和cyt基因编码。其中cry1类基因的表达产物对多种鳞翅目害虫具有较高的杀虫活性,但是由于检测方法的局限性,快速、准确地鉴定已知和未知基因有一定的难度。为了充分发掘Bt菌株中cry1类基因资源,本研究建立了一个高分辨率的筛选cry1类基因的PCR - RFLP方法。通过生物信息学软件对cry1类模式基因进行聚类分析,根据全长基因的5’及3’端差异将cry1类基因分成4个大类,分别设计通用引物,酶切分析只需要区分一个大类中的几个基因,提高了分辨率。该方法可以快速、准确、有效地对Bt菌株中的cry1类基因进行分型,特别是可以检测出已知及新型的cry1类基因。 通过原有的cry1类基因PCR - RFLP鉴定方法和新建立的体系对3株含有多种cry1类基因的Bt菌株进行了鉴定,发现原有体系在cry1类基因较多时无法准确检测,而且不能确定是否含有cry1I类基因,而新的体系对3株Bt菌株都达到了准确鉴定的目的,并且发现了一些国内还没有报道过的基因型,如cry1Hb、cry1Ja、cry1Ka、cry1La等。新体系不仅适用于单基因样品的分型,也适用于一株菌株中含有多个基因的样品的分型。 应用新建立的平台对72株苏云金芽胞杆菌标准菌株和86株Bt野生菌株进行cry1类基因型的鉴定,发现标准菌株中有11株含有cry1类基因,而野生菌株中绝大部分都含有cry1类基因,从中选取了19个cry1新基因。另外根据Bt标准菌株T03B001的全基因组测序结果,发现了两个cry1新基因。 根据这些基因的全长序列设计扩增cry1类基因的全长引物,成功克隆上述基因,除cry1Na外,20个cry1基因被国际Bt命名委员会正式命名为cry1Aa16、cry1Ab23、cry1Ab24、cry1Ah3、cry1Ai2、cry1Ba7、cry1Bb2、cry1Be4、cry1Ca12、cry1Da3、cry1Ea9、cry1Fa3、cry1Fa4、cry1Hb2、cry1Ia19、cry1Ib5、cry1Ie2、cry1Ja2、cry1Ka2、cry1La2。利用表达载体pEB在大肠杆菌Rosetta(DE3)中对这些基因进行表达,表达产物为60 - 130 kDa左右的蛋白。除Cry1Ka2和Cry1La2两种蛋白外,其它的Cry1蛋白都对敏感小菜蛾有毒力。没有活性报道的Cry1Hb蛋白对小菜蛾和棉铃虫都有毒力,LC50分别为305.82(241.66 - 391.76)μg/mL和315.12(225.68 - 456.86)μg/mL。Cry1Ba7和Cry1Ea9两种蛋白对大猿叶甲有较高的毒力,LC50分别为5.21(3.84 - 8.65)μg/mL和55.78(43.40 - 88.42)μg/mL,其中Cry1Ea对鞘翅目害虫的活性未见报道。Cry1Ca12对甜菜夜蛾有较高的毒力,LC50为89.11(60.54 - 121.26)×10-3μg/mL。Cry1Ie2和Cry1Na两种蛋白对亚洲玉米螟有较高的毒力,LC50分别为0.12(0.09 - 0.15)μg/mL和0.15(0.12 - 0.18)μg/mL。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S476.1;Q78

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