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《东北农业大学》 2012年
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苏云金芽胞杆菌芽胞期调控因子和Cry蛋白表达关系的研究

王新梅  
【摘要】:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),革兰氏阳性菌,芽胞杆菌属,其最明显的特征是在芽胞形成的同时会产生具有杀虫作用的晶体,对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目等农林业害虫具有特异性杀虫活性,是目前国际上应用最广泛最成功的微生物杀虫剂。晶体主要由杀虫晶体蛋白组成,杀虫晶体蛋白由cry或cyt基因编码。前人对不同类型的cry基因启动子的表达调控机制进行了较深入的研究,但对不同启动子的活性比较还未见报道。本研究比较了crylAc、cry3Aa、cry4A和cry8Ea基因启动子在芽胞期母细胞调控因子spoⅢD突变体中的活性,并对芽胞形成相关基因的sRNA进行了初步分析。 通过p-半乳糖苷酶活性测定说明spoⅢD突变对crylAc和cry8E基因启动子转录活性没有显著影响,对cry3A启动子转录活性略有提高,而对cry4A基因启动子影响较大。HD-73菌株中Pcry8E转录活性最高,Pcry4A次之,然后是PcrylAc, Pcry3A转录活性最低。在HD-ASpoIIID菌株中四个启动子的转录活性高低顺序与HD-73野生型菌株中一致,Pcrv8E转录活性在HD-73菌株和spoⅢD突变株都是最高的。 利用660nm蛋白定量试剂盒对上清液中总蛋白定量,取相同蛋白量上样,进行SDS-PAGE电泳。结果表明,在HD-ASpoIIID菌株中,总蛋白量相同的条件下,PcrylAc、 Pcry8E指导的crylAc蛋白产量较高,Pcry4A次之,Pcry3A指导的CrylAc蛋白产量最低。对小菜蛾的室内生物活性,与不同启动子指导的蛋白产量的分析结果一致。 为了分析crylAc野生拷贝对不同cry启动子指导crylAc基因表达的影响,在spoⅢD突变体基础上通过高温缺失了pHT73大质粒,获得了无晶体无芽胞突变体HD--ASpoIIID.在HD'-ASpoIIID菌株中,总蛋白量相同的条件下,PcrylAc、Pcry8E指导的crylAc蛋白产量较高,Pcry4A次之,Pcry3A指导的PcrylAc蛋白产量最低,与HD-SpoIIID菌株中的蛋白表达情况一致。说明含有crylAc野生拷贝对于分析不同cry类型启动子强弱无显著的影响。 通过上述分析筛选出了在HD-ASpoIIID菌株中适合表达外源基因的高活性启动子cry8E基因的启动子,为构建高效表达体系奠定了基础,同时也为新农药的开发提供了表达元件。 对SM培养基中野生型菌株T0,T3,T7时期RNA混合样品进行30nt左右片段测序,对所得数据进行生物信息学分析,得到了15个芽胞形成与发育有关基因的候选sRNA。通过RT-PCR对候选sRNA转录活性以及上下游基因之间的关系分析初步确定了一个sRNA。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S476.1

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【参考文献】
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