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《东北农业大学》 2012年
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玉米主效抗丝黑穗病候选基因预测及dCAPS标记开发

阚帅帅  
【摘要】:玉米丝黑穗病是由丝轴黑粉菌(Sphacelotheca reiliana (Kuhn) Clint)引发的一种绝产性病害。研究表明,玉米对丝黑穗病的抗性受多个数量性状位点(QTL)控制,在玉米染色体的bni2.09区域检测到主效抗玉米丝黑穗病位点,并开发了部分连锁及功能标记,但关于其相关基因的克隆和利用却未见报道。本研究拟在利用现代生物信息学方法针对玉米主效抗丝黑穗病区域(bni2.09)进行抗病候选序列挖掘的基础上,以仅含主效抗丝黑穗病近等基因系及其亲本为材料,利用TA-克隆法及DNAMAN软件对预测出的候选抗病序列分别进行克隆和抗病关联分析,筛选与玉米主效抗病基因关联的候选抗病序列并开发dCAPS标记,旨在为玉米抗丝黑穗病候选基因的挖掘和分子标记辅助育种提供技术支持。本研究的主要研究结果如下: (1)以玉米自交系B73RefGen_v2染色体上2.09区域的DNA序列为研究对象,利用基因预测软件Fgenesh,以真核生物中单子叶植物为参考文件,基于隐马尔科夫链模型(HMM)进行基因结构预测,结果显示,在染色体bin2.09区域内共具有1356条具有连续、完整的开放阅读框(ORF)的外显子结构的序列。利用蛋白质结构预测软件InterProScan对1356条序列所对应的氨基酸序列分别进行蛋白质结构域预测,结果表明,仅有452条氨基酸序列具有保守结构域,其中,含有抗病保守结构域NBS/LRR的4条序列被确定为抗病候选序列,分别命名为YC1、YC2、YC3、YC4。 (2)利用ORF Finder软件在线识别抗病候选序列的开放阅读框(ORF),结果显示,抗病候选序列YC1全长665bp,ORF长663bp。抗病候选序列的BLASTp比对发现,YC1与(?)穗短柄草的抗性基因RPP13、水稻的抗病基因RPM1及抗叶锈病基因LR10、小麦抗条锈病基因Yr10及抗叶锈病基因Lr10等的相似性为42%-54%;抗病候选序列YC2全长1378bp,ORF长1317bp,其与二穗短柄草抗性基因RPP8、小麦抗条锈病基因Yr10、高粱的抗条锈病基因Yr10/Mlal相似性为49%-63%;抗病候选序列YC3全长959bp,ORF长957bp,其与二穗短柄草的抗性基因RPM1、水稻的抗病基因MLA1、大麦的NBS-LRR-S/TPK型抗秆锈病相似性为38%-41%;抗病候选序列YC4全长890bp,ORF长888bp,其与水稻的抗病基因RPM1及RGH2A、高粱的抗病基因RPM1相似性分别为34%-46%。同时,4条抗病候选序列蛋白质理化性质的初步预测结果表明,4条候选序列都具有多个疏水结构域,均匀分布在整个氨基酸序列中,且都含有构成蛋白质特异功能结构组件的大量无规则卷曲结构,说明4条抗病候选序列具有特定功能,而非无意表达。 (3)以高抗玉米丝黑穗病自交系Mo17、齐319及Mo17供体近等基因系L44、齐319供体近等基因系L272,感病自交系黄早四为材料,利用TA-克隆方法,从5份材料中均成功克隆出4条抗病候选序列。通过DNAMAN软件的序列比对发现,从4份抗病材料中克隆出的候选序列与生物信息学预测得到的YC1、YC2、YC3、YC4序列相似性分别可达99.25%-99.55%、99.56%-99.78%、99.48%-99.58%和99.33%-99.55%,从感病材料中克隆出的候选序列与生物信息学预测得到的4条序列相似性分别99.40%、99.64%、99.58%和99.55%。 (4)利用DNAMAN序列比对软件,针对Mo17、齐319、L44、L272及黄早四材料中克隆出的4条抗病候选序列分别进行关联分析,结果表明,YC1、YC2、YC3在抗、感材料间并未存在差异位点。而在YC4中,第808个碱基位点上,在抗、感材料间存在1个差异位点,即抗病材料中的G位点在感病材料中突变成了C位点(即G→C),确定该位点是一个玉米主效抗丝黑穗病区域内与抗丝黑穗病相关的SNP位点。 (5)本研究成功将抗病候选序列YC4产生的1个SNP差异位点转化为dCAPS标记。以65份已知丝黑穗病抗性自交系为材料,建立BSA池,通过卡方适合性检验分析发现,dCAPS1标记可有效的筛选高感丝黑穗病以上级别材料,而对高抗丝黑穗病、抗丝黑穗病、中抗丝黑穗病和感丝黑穗病材料的内部选择则是无效的。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S513

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