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《东北农业大学》 2012年
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硫酸黏菌素致小鼠神经毒性初探及其毒代动力学研究

林巍  
【摘要】:黏菌素是多黏芽孢杆菌培养液中获得的碱性环状多肽类抗生素,治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的有效药物,但因其具有神经毒性和肾毒性使黏菌素的应用受到极大限制。近年来多重耐药革兰氏阴性“超级细菌”的出现,使黏菌素越来越受到世界各国学者的关注,其临床应用价值得到重新认识和再评价,所以明确其毒性作用机制对探寻新的减毒措施具有重要的指导意义。本试验选用小鼠作为试验动物,从体外和体内两方面对硫酸黏菌素的神经毒性进行研究,并初步探讨其神经毒性发生的可能机制。 选用18-22g昆明小鼠进行急性毒性试验,测定静脉注射硫酸黏菌素的半数致死量;在毒代动力学实验中,将60只昆明小鼠以最大耐受量尾静脉注射硫酸黏菌素,分别在给药后0.17、0.33、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、12和24h麻醉处死6只小鼠,分离血浆和组织,UPLC/MS/MS法测定血浆和组织中硫酸黏菌素的浓度;另取18只小鼠,测定给药后1h和24h的血液生化指标。亚急性试验中,选用48只昆明小鼠,随机分为空白对照组及硫酸黏菌素低、中、高剂量给药组,每组12只,给药组以2.5、5.0、7.5mg·kg-1剂量连续静脉给予硫酸黏菌素7d,空白对照组注射生理盐水。观察临床症状,末次给药后24h,处死小鼠,检测血清、脑、脊髓组织中N-乙酰基神经氨酸含量和乙酰胆碱酯酶活性;另选择昆明小鼠48只,以2.5、5.0和7.5mg·kg-1剂量尾静脉注射硫酸黏菌素,对照组每天注射生理盐水,连续注射7d;在给药前和给药后第1、3、7、14d,进行神经行为学测试(步态、网格指数和热觉传导速率试验)。以上毒性作用试验结果表明: (1)小鼠静脉注射硫酸黏菌素的半数致死量为12.5mg·kg-1,可见其注射途径给药毒性较高,注射后出现明显的毒性症状。 (2)毒代动力学实验中,建立了血浆和组织中硫酸黏菌素含量测定的超高效液相串联质谱法;静脉给予最大耐受量硫酸黏菌素后,小鼠身上可呈现硫酸黏菌素在临床中出现的肌肉无力、共济失调、呼吸困难、呼吸衰竭等毒性症状,说明小鼠对硫酸黏菌素的潜在毒性具有敏感性,可以用来作为硫酸黏菌素毒性试验动物模型;血浆毒代动力学结果表明硫酸黏菌素易分布到各组织中,其中血浆AUCo-∞为25.5μg·h·mL-1;t1/2λz:为9.8h;表观分布容积为5.5L·kg-1;组织毒代动力学显示硫酸黏菌素在脑组织中半衰期最长,在肾组织中暴露水平最高,表明脑组织是其蓄积的主要器官,肾组织是其毒性作用的主要靶器官。 (3)在亚急性毒性试验中,硫酸黏菌素中剂量组(5mg·kg-1)和高剂量组(7.5mg·kg-1)能够显著增加小鼠血清中N-乙酰基神经氨酸含量以及脑和血清中乙酰胆碱酯酶活性,降低小鼠脑和脊髓组织中N-乙酰基神经氨酸含量;神经行为学测试,高剂量组硫酸黏菌素可使小鼠出现行为学变化。提示硫酸黏菌素能引起脑、脊髓神经元损伤和凋亡,影响小鼠的运动和感觉神经功能。 以原代培养的小鼠背根神经节(DRG)神经元为研究对象,在含终浓度硫酸黏菌素为0、62.5、125、250和500μg·mL-1的DMEM/F12培养液中培养24h后,从细胞形态学变化、生化角度、DNA断裂变化、氧化应激、细胞内外游离Ca2+浓度等方面,探讨硫酸黏菌素对小鼠DRG神经元的毒性机制。试验结果表明: (1)形态学观察、AO/EB双荧光染色、Hoechst33258染色、DNALadder检测、Caspase-3活性变化等结果显示,硫酸黏菌素125μg·mL-1剂量组可导致DRG神经元病变,但无明显细胞凋亡变化250μg·mL-1和500μg·mL-1剂量组硫酸黏菌素可导致小鼠DRG神经元发生病变和凋亡,且病变和凋亡程度具有剂量依赖性,说明硫酸黏菌素对小鼠DRG神经元有毒性作用。 (2)随着硫酸黏菌素浓度的增加,小鼠DRG神经元中ROS活性升高,GSH含量降低,打破细胞的氧化还原平衡,导致氧化应激,致使DRG神经元氧化损伤,揭示氧化应激可能是硫酸黏菌素的神经毒性机制之一 (3)随着硫酸黏菌素浓度的增加,小鼠DRG神经元细胞培养液中乙酰胆碱含量降低。提示硫酸黏菌素可使神经元突触末梢释放乙酰胆碱的量减少。 (4)随着硫酸黏菌素浓度的增加,小鼠DRG神经元细胞内[Ca2+]i浓度升高,细胞培养液中[Ca2+]i浓度降低,提示细胞内外[Ca2+]i浓度变化可能是硫酸黏菌素导致DRG神经元细胞发生凋亡的机制之一。 综上所述,硫酸黏菌素在体内外均能够引起小鼠神经元形态改变,神经元氧化应激,通过Ca2+等途径诱导神经元细胞凋亡,造成神经系统损伤,引发其神经毒性。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S858.91

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