收藏本站
《东北农业大学》 2012年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

DA品系大鼠胚胎干细胞系的建立及多能性检测

李天达  
【摘要】:胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)是一类来源于哺乳动物囊胚阶段内细胞团的多能性细胞。自从1981年大类首次成功建立了第一株小鼠胚胎干细胞以来,由于其能够在体外无限扩增,并且具有发育的多能性,所以利用胚胎干细胞在基因功能的研究,基因修饰,以及细胞治疗和临床应用等都有广阔的应用前景。大鼠是第一种用于科学研究的哺乳动物。由于大鼠体型适中,并且与小鼠相比其生理调节和药理反应等方面与人类的相关性更近,因此在过去的150年间,大鼠被作为动物模型被广泛地应用于生理学、移植医学、免疫学、遗传学、神经科学、癌症和老化等领域的研究,尤其是某些特殊疾病,例如神经疾病和心血管疾病的研究更具有优势。然而,在小鼠胚胎干细胞建立后的二十几年中,人们一直没有成功的建立起真正的大鼠胚胎干细胞。这就使得大鼠在基因敲除动物模型领域的研究远远落后于小鼠。直到2008年,华人科学家应其龙等利用N2B27并添加抑制因子(3i:CHIR99021,PD184352,SU5402或2i:CHIR99021,PD0325901)的无血清培养体系首次分离得到了具有种系嵌合能力的真正的大鼠ESCs。随后又报道了通过大鼠胚胎干细胞进行基因打靶(Gene targeting),并成功获得TP53基因敲除大鼠。从而解决了限制大鼠转基因模型研究的瓶颈。 本研究使用无血清培养液N2B27并添加抑制因子PD0325901,CHIR99021以及Lif的培养体系,从DA品系大鼠囊胚中分离得到了大鼠胚胎干细胞。经鉴定其具有典型的胚胎干细胞形态,呈克隆状,贴壁或悬浮生长:碱性磷酸酶染色结果呈阳性,且具有正常的二倍体细胞核型;经过PCR,免疫荧光染色和Western blot等方法检测,我们所建立的DA大鼠胚胎干细胞表达Oct4,Nanog,Sox2,SSEA-1,FGF4,Rex1和Eras等细胞多能性因子;在体外长期传代培养仍能够维持自我更新的状态。 DA大鼠胚胎干细胞在无Lif的条件下可以在体外分化成拟胚体(Embryoid bodys, EBs);将大鼠胚胎干细胞注射到F344品系的二倍体囊胚中可以得到嵌合体大鼠;研究发现囊胚作为受体相比四细胞胚胎可以得到更高的二倍体嵌合效率;大部分嵌合体大鼠可以存活至成年,并将其与SD品系大鼠交配后能够得到种系嵌合的子代大鼠。因此,上述研究证明了我们所建立的DA大鼠胚胎干细胞是具有种系嵌合能力的、真正的大鼠胚胎干细胞。 本研究发现一种新的大鼠胚胎干细胞培养体系(N2B27-4i),即在经典的无血清N2B27-2i培养液的基础上添加了另外两种抑制因子Y-27632和A-83-01。结果表明N2B27-4i培养体系有利于维持大鼠胚胎干细胞体外长期传代培养,并证明了使用该体系可以显著提高胚胎干细胞的体外增殖速度。研究进一步证明了N2B27-4i培养体系下培养的大鼠胚胎干细胞具有产生嵌合体大鼠和种系嵌合的能力,尤其是相比传统N2B27-2i培养体系可以提高较高代次的大鼠胚胎干细胞产生嵌合体及种系嵌合效率。 利用大鼠胚胎干细胞做为供体细胞进行大鼠核移植的研究,结果表明体外培养体系不能支持大鼠核移植胚胎的发育,而利用体内移植的方法可以发育并得到大鼠核移植囊胚。从这些核移植囊胚中可以分离得到核移植胚胎干细胞(ntES),经鉴定其具有典型的大鼠胚胎干细胞形态,并具有一定的多能性。进一步研究的结果表明,大鼠胚胎干细胞核移植胚胎在体内具有发育到E11.5天的能力,而没有获得发育到期的大鼠胎儿。 综上所述,本研究所建立的DA品系大鼠胚胎干细胞系,是具有种系嵌合能力的大鼠胚胎干细胞。同时,也是国内首次得到真正意义的大鼠胚胎干细胞。该研究成果将会极大的促进国内大鼠胚胎干细胞及大鼠转基因模型领域的研究进展,并且在未来将会用于基因敲除大鼠疾病模型的制作,最终为人类疾病研究和药物研发提供优良的大鼠疾病动物模型。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:Q813

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨桦;胚胎干细胞培养特性及其分化能力的研究进展[J];国外医学.遗传学分册;1998年01期
2 郭义峰!200003,闵志廉!200003;克隆技术与组织器官移植[J];中华泌尿外科杂志;2001年03期
3 王国云,孔北华,李栋,张辉,白增亮;昆明鼠胚胎干细胞的分离培养与鉴定[J];山东大学学报(理学版);2004年03期
4 赵明,任彩萍;胚胎干细胞诱导分化的研究进展[J];生命科学;2005年01期
5 申宁馨;;克隆细胞——帕金森病治疗新武器[J];今日科苑;2008年09期
6 姚;胚胎干细胞的特性、体外分化及其应用前景[J];上海免疫学杂志;1999年03期
7 ;德专家告诫慎用胚胎干细胞移植法治疗脑疾[J];国外科技动态;2002年07期
8 沈干,丛笑倩,刘晓音,汪铮,曹谊林;胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的研究[J];国外医学.生物医学工程分册;2002年04期
9 李相运;胚胎干细胞的体外诱导分化[J];家畜生态;2002年04期
10 郭玉山 ,赵长根;德国允许开展胚胎干细胞研究[J];全球科技经济瞭望;2002年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 秦茂林;蔡文琴;张吉强;李成仁;李巍;;雌二醇对胚胎干细胞神经定向分化诱导的影响[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年
2 徐小明;窦忠英;华进联;葛秀国;;免疫外科法分离克隆BALB/c小鼠胚胎干细胞[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
3 蒋晖;瞿东滨;金大地;鞠躬;;新型神经营养因子TAT-BDNF促进胚胎干细胞的神经元性分化[A];第一届全国脊髓损伤治疗与康复研讨会暨中国康复医学会脊柱脊髓损伤专业委员会脊髓损伤与康复学组成立会论文汇编[C];2009年
4 于洲;徐海滨;;应用胚胎干细胞实验模型体系对异硫氰酸盐发育毒性的研究[A];2010年全国药物毒理学学术会议论文集[C];2010年
5 刘平;关云谦;邹春林;张愚;陈彪;刘焯霖;;胚胎干细胞在体内外诱导分化成为多巴胺能神经的初步研究[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年
6 隋婧;姜方旭;施秉银;;胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的基因表达谱分析[A];中华医学会第十次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2011年
7 胡敏华;区颖蕾;李莉;郭欣政;张守全;;胚胎干细胞饲养层的优化及影响内细胞团贴壁率的探讨[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
8 马育芳;杨阳;李燕;王少华;赵蕊;李宁;;猪胚胎干细胞多能性因子Nanog对胚胎发育的影响[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
9 曹楠;杨黄恬;;大鼠胚胎干细胞向心肌细胞体外分化的研究[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
10 田孝祥;韩雅玲;康建;徐凯;闫承慧;;利用胚胎干细胞建立贴壁制备胚胎小体的新方法[A];中华医学会心血管病学分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张树庸 赵贵英;干细胞研究的突破[N];人民日报;2009年
2 记者 刘霞;英用胚胎干细胞制造出红血球[N];科技日报;2010年
3 孙国根;复旦大学成功提取首个大鼠胚胎干细胞[N];中国医药报;2009年
4 本报首席记者 任荃;第二颗“全能种子”会不会抢先“发芽”[N];文汇报;2009年
5 刘霞;美用胚胎干细胞制造出血小板[N];科技日报;2011年
6 记者 郑晓春;科学家发现胚胎干细胞分化机制[N];科技日报;2008年
7 记者 李大庆;“小小”入选《时代周刊》2009年十大医学突破[N];科技日报;2009年
8 曹淑芬;用胚胎干细胞生成骨骼[N];中国中医药报;2001年
9 闫洁;胚胎干细胞治疗:首次临床试验[N];新华每日电讯;2010年
10 记者 黄堃;利用人类卵细胞,成功培养出胚胎干细胞[N];新华每日电讯;2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 谭舟;MK和GM-CSFRα在胚胎干细胞中的表达与功能研究[D];浙江大学;2010年
2 李天达;DA品系大鼠胚胎干细胞系的建立及多能性检测[D];东北农业大学;2012年
3 苏中渊;胚胎干细胞来源的间充质干细胞归巢及胚胎干细胞表面分子的研究[D];浙江大学;2010年
4 廖宏庆;人类不同原核数目受精卵中筛选正常优质胚胎的策略研究[D];中南大学;2010年
5 白春玲;牛孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的研究[D];内蒙古大学;2011年
6 曲文玉;人胚胎干细胞的分离、培养及建系[D];中国医科大学;2006年
7 李相运;小鼠胚胎干细胞多能性研究[D];西北农林科技大学;2001年
8 姚嘉宜;胚胎干细胞重新编程肿瘤细胞的研究[D];第二军医大学;2008年
9 赵惠萍;骨髓内皮细胞条件培养液诱导胚胎干细胞向造血细胞分化[D];中南大学;2003年
10 刘星霞;胚胎干细胞ES-D_3诱导分化为胰岛素分泌细胞及其对糖尿病鼠降糖作用的研究[D];山东大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙国杰;山羊类胚胎干细胞的分离、克隆[D];河北农业大学;2002年
2 吕一帆;胚胎干细胞在内膜损伤小鼠宫腔内移植的实验研究[D];福建医科大学;2010年
3 周文平;小鼠三种胚胎干细胞表观相关基因的分析[D];河南大学;2011年
4 姜静宜;胚胎干细胞中外源性IbeB靶蛋白的筛选及验证[D];中国医科大学;2010年
5 蔡斌;体外诱导胚胎干细胞为神经细胞模型的建立及相关因子的实验研究[D];第二军医大学;2001年
6 顾文佳;诱导胚胎干细胞向神经细胞分化的研究[D];中国医科大学;2004年
7 刘愿;小鼠球形精子受精胚胎制备及培养方法的改进[D];山东师范大学;2011年
8 秦茂林;小鼠胚胎干细胞的分离、鉴定和神经定向诱导分化[D];第三军医大学;2001年
9 吕志一;小鼠2细胞胚胎基因表达谱研究[D];西北农林科技大学;2010年
10 曲智;大鼠气管粘膜上皮细胞损伤修复过程中胚胎干细胞相关基因OCT3/4的表达及其意义[D];中国医科大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026