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《东北农业大学》 2013年
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小鼠孤雄胚胎干细胞的建立和应用

帅领  
【摘要】:孤雄胚胎由于缺少母源基因组而不能发育到期得到存活的动物,但是孤雄胚胎能够在体外发育至囊胚并且建立孤雄胚胎干细胞系。由于孤雄胚胎干细胞的印记基因的表观遗传状态在体外培养过程中很难得到改变,所以导致其产生嵌合体的能力较低。本研究借助“一步法”核移植技术高效地进行孤雄胚胎的重构,并利用一种化学小分子-CBHA去处理孤雄胚胎,通过整个基因组的表观遗传修饰来改变孤雄胚胎的发育潜能及孤雄胚胎干细胞的多能性。与没有经过CBHA处理的对照组相比,实验组的孤雄胚胎在体外有较高的囊胚率,并且相应的孤雄胚胎干细胞也能够通过囊胚注射的方法获得健康的嵌合体动物。通过亚硫酸氢盐测序发现,CBHA处理过后得到的孤雄胚胎干细胞的H19的差异甲基化区域(DMR)的甲基化状态得到了改变。同时, real-time PCR实验分析发现这些孤雄胚胎干细胞中的印记基因H19、Dio3和U2af1-rs1的基因表达量已趋近于受精卵来源的胚胎干细胞的表达量。CBHA所带来的这些分子生物学变化有可能与孤雄胚胎干细胞多能性改善有关,这也为我们提供了一种改变孤雄胚胎干细胞多能性的新方法,同时也对于我们更好的理解表观遗传调控提供了新的研究思路。 孤雄单倍体胚胎可以通过“一步法”核移植技术将精子注射入去核卵母细胞中得到,这些胚胎可以建立得到孤雄单倍体胚胎干细胞系。孤雄单倍体胚胎干细胞具有典型的胚胎干细胞的集落,表达多能性标记物,能够形成畸胎瘤和嵌合体,同时还具有生殖系嵌合的能力,是一类新型的具有多能性的胚胎干细胞。通过对孤雄单倍体胚胎干细胞构建的嵌合体胚胎进行DNA含量分析发现,在嵌合体胚胎发育第6.5(E6.5)天时仍然可以检测到单倍体的存在,所以,本研究通过将孤雄单倍体胚胎干细胞进行体外分化,获得了上胚层样的单倍体胚胎干细胞(Haploid EpiSC-like cells)系。随后,将这些上胚层样的单倍体胚胎干细胞进行神经分化,能够迅速地得到神经干细胞,并且这些神经干细胞中也有一定比例的单倍体细胞存在。本研究在卵母细胞胞浆内注射孤雄单倍体胚胎干细胞,然后将这些胚胎移植到假孕母鼠体内,进而获得了健康的可育小鼠。最后,本研究通过随机突变的方法向孤雄单倍体胚胎干细胞中引入新霉素抗性基因Neor,并借助G418筛选和流式分选的富集得到了转基因的孤雄单倍体胚胎干细胞系,最后借助卵母细胞胞浆内注射的方式获得了健康存活的转基因小鼠。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:Q813

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