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《东北农业大学》 2013年
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大豆根部内生放线菌的筛选、鉴定及其活性代谢产物研究

刘重喜  
【摘要】:大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉引起的全球性大豆病害。而在某些大豆疫霉发病的大田中会发现在已发病的植株邻近会有健康成活的植株。这一现象是否与植物内生放线菌协助植物抗病有关?因此本研究以这种健康大豆植株的根部作为分离对象,进行内生放线菌分离。对已筛选的菌株进行新属、种鉴定及抗大豆疫霉活性评估,并利用活性追踪的方法对其活性代谢产物进行了研究,结果如下: (1)从健康的大豆根部分离得到内生放线菌29株,其中包括链霉菌属19株,小单孢菌属7株,链孢囊菌属1株,野野村氏菌属1株和王氏放线菌属1株。 (2)利用多相性分类对菌株NEAU-J3进行分类学鉴定。16S rRNA基因序列分析显示该菌属于小单孢菌科。菌株NEAU-J3细胞壁氨基酸为内消旋二氨基庚二酸,细胞水解糖为半乳糖、核糖和葡萄糖,醌组主要为MK-9(H4)和MK-9(H6),磷酸类脂为磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺,脂肪酸主要为C16:0,C18:1ω9c,C18:0,C17:0,C17:1ω7c,anteiso-C17:0,C16:1ω7c和C15:0,基因组G+C mol%为62.5mol%。通过形态特征、化学分类学分析、系统分类学分析及16S rRNA特征性核苷酸分析确定菌株NEAU-J3属于小单孢菌科的一个新属,命名为Wangellaharbinensis,保藏在中国科学院微生物研究所和德国不伦瑞克市德国菌种保藏中心(=CGMCC4.7039T=DSM45747T)。 (3)利用多相性分类对菌株NEAU-Da3进行分类学鉴定。16S rRNA基因序列分析显示该菌属于链霉菌属。菌株NEAU-Da3与Streptomyces carpaticus NRRL B-16359T(99.5%),Streptomyces cheonanensis VC-A46T(99.3%),Streptomyces xiamenensis MCCC1A01550T(97.2%)和Streptomyces sodiiphilus YIM80305T(97.1%)的16S rRNA基因序列相似性最高,与链霉菌属的其它模式菌株的相似性均低于97%。通过邻位连接法和最大似然法将菌株NEAU-Da3与同源性高的链霉菌菌株构建系统发育树,我们发现,两种方法得到的拓扑结构十分一致,菌株NEAU-J3与S. carpaticus NRRL B-16359T,S. cheonanensis VC-A46T及S.xiamenensis MCCC1A01550T形成独立分支,其所显示高的靴值支持了这个分支。通过形态特征、生理生化特性、系统分类学分析及DNA杂交分析确定NEAU-Da3属于链霉菌的一个新种,命名为Streptomyces harbinensis,保藏在中国科学院微生物研究所和德国不伦瑞克市德国菌种保藏中心(=CGMCC4.7047T=DSM42076T)。 (4)利用多相性分类对菌株NEAU-W2进行分类学鉴定。菌株NEAU-W2具有典型的链霉菌形态和化学分类学特征。基因组G+C mol%为66.12mol%。16S rRNA基因序列分析显示该菌株与其相似性最高的Streptomyces neyagawaensis ATCC27449T(99.61%)形成独立的分支,而DNA杂交显示它们的基因组同源性只有58.51%。此外,菌株NEAU-W2可以与S.neyagawaensis ATCC27449T及其他相似性高的链霉菌菌株(98–99%)以及产勃利霉素的其他菌株在形态和生理生化特性上进行明显区分。通过形态特征、生理生化特性、系统分类学分析及DNA杂交分析确定NEAU-W2属于链霉菌的一个新种,命名为Streptomycesheilongjiangensis,并保藏在在中国科学院微生物研究所,美国模式培养物集存库和德国不伦瑞克市德国菌种保藏中心(=CGMCC4.7004T=DSM42073T=ATCC BAA-2424T)。 (5)体外活性评估实验显示,新种NEAU-W2具有极强的抗大豆疫霉活性。通过活性追踪法对菌株NEAU-W2所产抗大豆疫霉活性化合物进行分离,并通过UV、IR、1H NMR、13C NMR、ESI-MS和HRESI-MS对活性化合物的结构进行表征,鉴定该活性化合物为勃利霉素。在对勃利霉素抗大豆疫霉活性评估时,勃利霉素对大豆疫霉1号生理小种的EC50和EC95值分别为0.0056和0.026mg/L,该值比商品化的抗大豆疫霉药剂甲霜灵分别低了62.5和262.3倍。研究者进一步对大豆疫霉生理小种1进行活体内活性评估,在浓度为10mg/L时,其对大豆疫霉的防效达到了94.72%,比在同样有效浓度时的25%甲霜灵可湿性粉剂的防效要高。以上研究说明了勃利霉素很有希望成为新一代大豆疫霉杀菌剂。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S435.651

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