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《东北农业大学》 2013年
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miR-142-3p对小鼠乳腺发育和泌乳重要功能基因Prlr的表达调控

李慧铭  
【摘要】:miRNAs在动物生长发育、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡等生命活动中具有广泛的调节作用,miRNAs近年已成为生命科学研究中的亮点。随着miRNAs的发现及其功能研究的深入,乳腺生长发育和泌乳表达调控的研究也进入了miRNA调控的新层面。miR-142-3p在多种细胞中有不同的功能,我实验室应用微阵列分析证实miR-142-3p在小鼠乳腺不同发育时期存在表达差异,但miR-142-3p如何调节小鼠乳腺发育和泌乳还不了解。 催乳素(PRL)是广泛存在于高等动物体内的一类重要激素,对调控动物乳腺发育和泌乳有重要作用。PRL发挥作用是通过与特定高度亲和性受体相结合而引发。PRL通过与靶细胞膜表面的催乳素受体(PRLR)相结合,由催乳素受体介导,启动JAK2/STAT5信号转导途径,最终激活反式作用因子STAT5将信号转入细胞内,进而作用于乳蛋白基因启动子区的靶序列,启动或增强以乳蛋白基因启动子为顺式作用元件的靶基因表达。在乳腺发育、泌乳和退化过程中,需要多种激素和细胞因子协同作用, PRLR在小鼠乳腺泌乳过程中的表达关系到小鼠乳腺泌乳以及乳品质。 Akt是丝/苏氨酸蛋白激酶超家族的成员,对细胞存活、增殖、代谢和凋亡中起作用。在Akt/mTOR信号通道中,Akt处于Akt/mTOR信号转导通路的核心地位。作为Akt下游的重要底物之一,TOR作为生长因子和营养信号的整合器,其上游刺激因子通过不同的细胞表面受体或靶蛋白,将信号转导至mTOR或直接作用于其下游效应器,进而调节细胞的生长和增殖。mTOR通路在乳腺上皮细胞代谢及生长方面发挥重要作用,研究结果提示,营养素和激素可通过mTOR途径调节乳蛋白合成。固醇调节元件结合蛋白(SREBP)属于核转录因子家族,是脂肪合成基因重要的转录调节因子,SREBP高表达可导致脂肪合成相关酶基因的高表达。研究发现,SREBP可能是乳腺脂肪酸合成的主要调节因子。乳腺中乳中脂肪酸链的形成,去饱和、脂肪酸链的延伸,以及脂肪合成过程一系列酶活性变化的上调可能与SREBP-1活性的升高有关。此外,SREBP-1在乳腺发育和泌乳过程中具有多重调节作用。GLUT1为构成小鼠、大鼠和牛的乳腺上皮细胞葡萄糖转运系统,定位于大多数细胞的质膜上,负责基础水平的葡萄糖吸收,它与能量代谢有密切关系。 本研究以小鼠乳腺上皮细胞系作为研究的细胞模型,通过脂质体转染法向细胞中转染miR-142-3pmimics/inhibitor,应用实时荧光定量PCR技术检测Prlr及其相关通路基因的变化,采用Western blotting技术检测miR-142-3p对PRLR等泌乳信号分子蛋白的影响。使用CASY细胞活力分析仪检测活细胞数和细胞活力的变化。同时,应用HPLC检测酪蛋白和乳糖分泌的变化,采用TG试剂盒检测细胞甘油三酯的分泌情况。实验结果表明: ①实时荧光定量PCR检测结果与芯片结果一致,miR-142-3p在小鼠乳腺的各个时期均有表达,与妊娠期、泌乳期和退化期小鼠乳腺相比,miR-142-3p在小鼠乳腺青春期的表达量最高,有显著差异(P0.05)。在泌乳期,miR-142-3p表达量最低(P0.05),推测miR-142-3p能够调控小鼠乳腺的发育及泌乳的周期性变化。 ②根据miR-142-3p对小鼠乳腺上皮细胞活力的CASY法测定及乳腺上皮细胞β-酪蛋白分泌水平的HPLC检测结果和甘油三酯的TG试剂盒检测,结果确定miR-142-3p抑制细胞的活力及增殖能力,进而抑制小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白和甘油三酯的生物合成,乳腺上皮细胞乳糖分泌水平的HPLC检测结果显示,miR-142-3p对小鼠乳腺上皮细胞乳糖分泌无显著影响。 ③荧光定量PCR和Western Blotting技术检测结果显示,miR-142-3p抑制内源性PRLR基因和蛋白的表达,影响PRLR相关泌乳信号分子的表达。过表达miR-142-3p时,细胞内SREBP、AKT1、mTOR、STAT5表达量均下降,抑制内源性miR-142-3p表达时,细胞内泌乳信号分子SREBP、AKT1、mTOR、STAT5表达均升高。推测miR-142-3p通过调控PRLR的表达,进而调控上述与乳蛋白和乳脂调控密切相关的泌乳信号分子。 ④本研究检测了过表达和抑制时,乳腺上皮细胞中GLUT1的表达情况,发现无论是过表达还是抑制,GLUT1的表达都升高,说明miR-142-3p对GLUT1的表达影响不大。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:Q75;Q575.13

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