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《东北农业大学》 2013年
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苏云金芽胞杆菌资源多样性分析与杀虫基因发掘

束长龙  
【摘要】:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt),革兰氏阳性细菌,在芽胞形成期可产生具有杀虫活性的伴胞晶体。Bt晶体主要由cry基因编码的杀虫晶体蛋白组成,在害虫的防治中具有重要作用,有巨大的商业价值,因此发掘新基因并进行知识产权保护是Bt资源研究的重要内容。知识产权作为综合竞争力的重要体现,而目前我国在Bt杀虫基因资源的知识产权方面处于劣势,大部分Bt杀虫基因的专利权掌握在西方各大型农业生物技术企业手中,我国掌握的Bt新的基因发明专利不足60项。高通量测序技术的发展为发掘杀虫基因提供了新思路,成为国内外发掘Bt杀虫基因的主要手段。但是测序价格较高,Bt资源库中存在的冗余菌株会造成较大的资金浪费,目前尚没有便捷的方法去除重复菌株。因此,迫切需要建立可以快速分析比较大量样品的方法,来排除重复菌株,进一步提高杀虫基因发掘效率。本论文在分离1500株Bt菌株的基础上,进一步建立了菌株多样性分析方法,对菌株多样性进行研究,去除冗余菌株,对其中90株菌株进行了杀虫基因测序筛选,主要结果如下: Bt菌株分离与鉴定:杀虫活性评估结果显示多数菌株对鳞翅目害虫有较高活性,1500株测试菌株中,对棉铃虫有活性的菌株有1346株,对玉米螟有活性菌株有813株,而对叶甲类害虫大猿叶甲有活性的菌株较少,只有42株;镜检结果显示不同菌株产生的晶体形状、大小、种类有较大差异,晶体种类主要为菱形,部分为球形和不规则的晶体形状;杀虫晶体蛋白图谱显示大部分菌株表达了130kD蛋白,部分菌株还表达了100Kd、60kD蛋白,具有典型Bt杀虫晶体蛋白的特征;质粒图谱显示不同菌株质粒图谱条带数量和大小都有所不同,并且有部分菌株图谱相似,说明资源库中有冗余菌株。 建立Bt菌株多样性分析方法:首先,设计了可以扩增多个基因家族的兼并引物,fastPCR软件分析结果显示该引物可以对超过30种的杀虫基因家族进行较好的扩增,PCR实验检测显示,该引物可以扩增出预期条带但是条带较弱。进一步通过增加侧翼特异序列的办法对兼并引物进行改良,改良后的引物显著提高了扩增效率。同时,还对引物浓度与退火温度进行了优化,利用72个不同血清型的标准菌对优化后的PCR体系进行了评估,结果显示95%以上的菌株都可以获得预期条带;利用含有多个基因的HD12菌株评估了优化后体系对多个基因同时扩增的能力,结果显示优化后的PCR可以从HD12获得9种不同的RFLP类型。这些结果说明优化后的PCR体系具备了cry基因指纹图谱的基本要求。此外,本论文还对Bt基因组提取方法进行了改良,改良后的方法可以提取并获得质量均一的基因组DNA。用改良的PCR体系对Bt基因组进行扩增,并用HinfI对PCR产物进行消化,利用LabChip GX电泳系统进行分析,获得了888个菌株的RFLP图谱。进一步对电泳图谱进行数字化、计算相似性、构建系统发生树分析。结果显示,该方法可以有效分析菌株多样性,去除冗余菌株,获得可用于进一步基因发掘的菌株。 90株Bt菌株杀虫基因测序筛选:利用高通量测序技术分析了90株不同的Bt菌株的序列,进一步通过SOAPdenovo软件拼接、GeneMark基因预测、模式杀虫基因数据库及专利数据库blast比对,最终获得全新杀虫基因21个。 总之,本论文建立菌株多样性研究方法,解决了冗余菌株会造成资金的浪费的问题,最终完成了“菌株分离去除冗余基因测序筛选”这一杀虫基因高通量发掘平台的构建,为提升我国在Bt资源发掘中的竞争力提供了重要保障。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S476.1

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 彭东海;陈守文;阮丽芳;李林;喻子牛;孙明;;苏云金芽胞杆菌基因工程菌BMB696B对实验动物的安全性评估[J];安全与环境学报;2006年06期
2 翟元娜;张杰;高继国;;苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A研究进展[J];东北农业大学学报;2009年08期
3 沙莉;黄振吉;关雄;;不同氮源对苏云金芽胞杆菌产几丁质酶的影响[J];福建农林大学学报(自然科学版);2011年04期
4 李小辉;夏立秋;袁灿;丁学知;尹佳;;苏云金杆菌4.0718菌株InhA的鉴定和不同生长时期的表达分析[J];湖南师范大学自然科学学报;2008年02期
5 周学永,陈守文;我国生物农药Bt下游技术研究中的问题及对策[J];农业环境保护;2002年05期
6 何晓明;束长龙;刘晓垒;李海涛;高继国;张杰;宋福平;;苏云金芽胞杆菌新型vip3Aa基因的克隆、表达与活性分析[J];农业生物技术学报;2011年05期
7 杜立新;王金耀;王容燕;曹伟平;宋健;冯书亮;;苏云金芽胞杆菌工程菌BIOT185对金龟子幼虫的田间防效及其安全性评价[J];农药学学报;2011年04期
8 高川;郎志宏;朱莉;宋福平;张永军;张杰;黄大昉;;转cry2Ab4和vip3Aa11基因烟草对小地老虎杀虫效果研究[J];中国农业科技导报;2012年05期
9 谢池楚;陈月华;蔡峻;刘传;陈艳玲;;Bt几丁质酶的基础表达及诱导合成的多态现象[J];生物工程学报;2010年11期
10 蔡启良,刘子铎,喻子牛;苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因特性分析[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年05期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 苏旭东;檀建新;张伟;林扬;;苏云金芽孢杆菌的分离与鉴定[J];安徽农业科学;2006年19期
2 郑琦;唐玉明;关雄;;苏云金芽胞杆菌cry基因研究进展[J];安徽农业科学;2012年22期
3 于亚军;夏新莉;尹伟伦;;果树抗虫基因工程研究进展[J];北方园艺;2008年07期
4 杨海霞;王欢;董辉;丛斌;;沈阳地区小菜蛾对五种常用杀虫剂的抗性测定[J];北方园艺;2011年18期
5 刘冰花;周红;张定玲;;苏云金芽胞杆菌的研究进展[J];成都大学学报(自然科学版);2007年01期
6 李先军;李强;杜超;王树艳;;Bt野生菌Q1杀虫晶体蛋白及基因型分析[J];承德医学院学报;2011年02期
7 王永,王勤英,檀建新,陆秀君,李国勋;苏云金杆菌新菌株WZ-7的PCR-RFLP分析及生物活性研究[J];河北农业大学学报;2003年03期
8 郭丽伟;苏俊平;宋萍;张冬冬;王勤英;;一株对蚊子幼虫高效的Bt新菌株的特性研究[J];河北农业大学学报;2011年05期
9 程林友,陆秀君,李国勋;对甜菜夜蛾高毒力Bt新菌株的PCR-RFLP分析及生物活性测定[J];东北农业大学学报;2005年02期
10 翟元娜;张杰;高继国;;苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A研究进展[J];东北农业大学学报;2009年08期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 吴昌标;林友照;薛萍;蔡思雄;关雄;;从动物上分离Bt及其对动物安全性评估[A];2008年福建省科协第八届学术年会农业分会场论文集[C];2008年
2 黄张敏;;苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的研究进展[A];第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 杜立新;苏云金芽胞杆菌cry8E基因转录调控机制研究[D];河北农业大学;2011年
2 宋萍;苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究[D];河北农业大学;2012年
3 周思军;大豆抗虫基因转移及其转化系统优化研究[D];东北农业大学;2000年
4 张杰;对鞘翅目害虫高毒力的Bt cry基因分离克隆和工程菌的构建[D];中国农业科学院;2000年
5 李长友;对鳞翅目害虫高毒力Bt菌株B-Hm-16和B-Pr-88的分子生物学研究[D];东北农业大学;2001年
6 宋福平;苏云金芽孢杆菌特殊异性cry基因的研究[D];东北农业大学;2001年
7 姚江;高效广谱苏云金芽孢杆菌Ly30株的分子生物学研究[D];中国农业科学院;2002年
8 陈中义;多功能质粒载体与组合Bt杀虫蛋白基因工程菌研究[D];中国农业科学院;2002年
9 戴小枫;中国植物保护科学技术发展战略研究[D];中国农业科学院;2003年
10 郑爱萍;微生物来源的防病、杀虫相关因子的分离与功能解析研究[D];四川农业大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李建平;甜菜蔗糖磷酸合酶基因的克隆、表达及其遗传转化[D];新疆农业大学;2010年
2 冯静静;苏云金杆菌cry7Ab8基因的克隆表达及工程菌构建[D];河北农业大学;2011年
3 张丽;食用菌厉眼蕈蚊生防菌苏云金杆菌的筛选及毒力测定[D];福建农林大学;2011年
4 王晓娇;农杆菌介导AVP1基因转化甜菜的研究[D];内蒙古农业大学;2011年
5 张彦伟;蔗糖转运蛋白基因在提高甜菜含糖量中的初步研究[D];石河子大学;2009年
6 毛云莹;成都平原农田土壤芽孢杆菌的分离鉴定及三株Bt菌的生物特性和毒力研究[D];四川农业大学;2011年
7 刘东明;苏云金芽胞杆菌新型cry1基因克隆、表达及活性分析[D];东北农业大学;2011年
8 何晓明;苏云金芽胞杆菌新型vip3基因克隆、表达及活性分析[D];东北农业大学;2011年
9 王一喆;小菜蛾高毒力苏云金芽胞杆菌的筛选与分子特性研究[D];华中农业大学;2011年
10 殷东林;蔗糖转运蛋白VvSUC11、VvSUC12在提高甜菜含糖量中作用的研究[D];石河子大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张振宇;李林;任红燕;吴晓明;喻子牛;孙明;;苏云金芽胞杆菌基因工程菌WG-001和1125BG在盆栽土壤中的安全性评估[J];安全与环境学报;2005年06期
2 严瑾;陈德局;陈守文;喻子牛;;胞内聚-β-羟基丁酸酯对苏云金芽胞杆菌营养细胞耐受性的影响[J];长江大学学报(自然科学版)农学卷;2010年02期
3 孙学俊;李春宏;卢刚;;小地老虎的生活习性及防治[J];国土绿化;2006年07期
4 邵志会,陈守文,徐建,喻子牛;苏云金芽孢杆菌BMB005的代谢动力学[J];工业微生物;2005年01期
5 吕早生;张敏;李凌凌;李征;;蜡状芽孢杆菌产聚羟基烷酸的提取与鉴定[J];化学与生物工程;2008年08期
6 王永祥,杨彦杰,柯汉英;冀中平原区蛴螬种类及综合防治技术[J];河北师范大学学报;1998年02期
7 施腾鑫;刘嘉;贺淹才;;黏质沙雷氏菌产几丁质酶的发酵工艺优化[J];华侨大学学报(自然科学版);2010年06期
8 范保星 ,刘又宁 ,孟凡义 ,任鲁风 ,吴小兵 ,张猛;SARS病毒全基因组芯片在临床检测中的应用[J];解放军医学杂志;2003年11期
9 王振国;刘和平;刘金华;蔡阳;肖成蕊;罗雁菲;徐宝梁;;应用PCR方法检测蜡样芽胞杆菌的研究[J];吉林农业大学学报;2006年06期
10 林进添,曾玲,梁广文,陆永跃,宾淑英;病原线虫对桔小实蝇种群的控制作用[J];昆虫学报;2005年05期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 牛颜冰;烟草抗病毒基因工程研究[D];浙江大学;2003年
2 黄志鹏;苏云金芽孢杆菌WB9的研究[D];福建农林大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 何晓明;苏云金芽胞杆菌新型vip3基因克隆、表达及活性分析[D];东北农业大学;2011年
2 苏慧琴;苏云金芽胞杆菌新型cry9基因克隆、表达及活性分析[D];东北农业大学;2010年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郭三堆;CrylA杀虫基因的人工合成[J];中国农业科学;1993年02期
2 郭凤蕊,董五辈;杀虫基因[J];河南科技;1996年01期
3 ;烟草含有杀虫基因[J];世界农业;1997年04期
4 林菲文;我国首次人工合成杀虫基因并导入棉花[J];中国生态农业学报;1994年04期
5 郭三堆,崔洪志;中国抗虫棉GFM CrylA杀虫基因的合成及表达载体构建[J];中国农业科技导报;2000年02期
6 谢道昕,范云六,倪丕冲;苏云金芽孢杆菌杀虫基因导入中国栽培水稻品种中花11号获得转基因植株[J];中国科学B辑;1991年08期
7 ;杀虫基因的合成、高效植物表达载体的构建及抗虫基因棉花的获得[J];农业科技通讯;1997年04期
8 ;杀虫基因的合成和高效植物表达载体的构建及抗虫转基因棉花的获得[J];农业科技通讯;1997年11期
9 蔡亚君,彭可凡,戴顺英,高梅影;1株广谱苏云金芽孢杆菌及其发酵条件的研究[J];华中农业大学学报;2003年05期
10 孙明,刘子铎,李林,喻子牛;细菌基因工程杀虫剂研究进展[J];中国病毒学;2000年S1期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 范云六;;苏云金芽孢杆菌杀虫基因的遗传工程[A];全国生物防治学术讨论会论文集[C];1991年
2 谭芙蓉;唐雪明;;四川生态区苏云金芽胞杆菌资源的筛选鉴定及其新型杀虫基因的克隆表达研究[A];第二届上海市植物生理学青年学术研讨会论文摘要集[C];2008年
3 王欢;丛斌;;几种微生物杀虫蛋白及杀虫蛋白基因的研究进展[A];第三届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第二届全国生物农药研讨会论文集[C];2004年
4 王少华;华金平;易先达;翟忠琴;陈道甫;张成;;国内棉花抗虫育种进展与方向[A];实施科技兴农战略促进农村经济发展学术交流论文集[C];2004年
5 徐静;寻广新;张青文;周明;杨青芹;;棉花抗虫工程菌在棉株内的动态变化和抗虫稳定性研究[A];新世纪(首届)全国绿色环保农药技术论坛暨产品展示会论文集[C];2002年
6 张春鸽;束长龙;高继国;宋福平;张杰;;高通量测序在苏云金芽胞杆菌基因发掘中的运用[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
7 孙明;;苏云金芽胞杆菌YBT-1520的功能组分析[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
8 喻子牛;孟盈;孙明;何进;李明顺;郑世学;;苏云金芽胞杆菌新基因资源的发掘策略[A];第三届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会会议论文摘要集[C];2011年
9 夏立秋;付祖娇;丁学知;孙运军;;苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究及其原毒素表达谱的质谱鉴定新方法[A];中国微生物学会《第二届全国农业微生物研究及产业化研讨会》和《第十一届全国杀虫微生物学术研讨会》暨《湖北省暨武汉市微生物学会和内蒙古微生物学会2008年会》论文摘要[C];2008年
10 周帼萍;闫建平;郑大胜;周晓慧;袁志明;;苏云金芽胞杆菌在食品中分布及来源分析[A];中国微生物学会《第二届全国农业微生物研究及产业化研讨会》和《第十一届全国杀虫微生物学术研讨会》暨《湖北省暨武汉市微生物学会和内蒙古微生物学会2008年会》论文摘要[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 刘培臣 李付广;携带两个杀虫基因[N];科技日报;2002年
2 ;创世纪转基因技术有限公司关于转基因抗虫棉杀虫基因专利知识产权的声明[N];农民日报;2001年
3 ;中国农科院生物技术研究所关于转基因抗虫棉杀虫基因专利知识产权的声明[N];农民日报;2001年
4 钱峰;C群流脑病人慎用磺胺类药物[N];大众卫生报;2006年
5 钱峰;治C群流脑病人慎用磺胺类药物[N];健康报;2006年
6 钟燕平;微观世界的巨人[N];农民日报;2008年
7 宋逊风;创世纪公司十年打下抗虫棉天下[N];农民日报;2008年
8 付迁;优质抗虫棉今年大丰收[N];科技日报;2002年
9 李禾;转基因抗虫棉:专门对付棉铃虫[N];科技日报;2005年
10 宋逊风;创世纪公司依法维护专利权胜诉[N];农民日报;2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 束长龙;苏云金芽胞杆菌资源多样性分析与杀虫基因发掘[D];东北农业大学;2013年
2 张文飞;苏云金芽孢杆菌分离与新型cry基因资源的挖掘[D];广西大学;2011年
3 武东亮;融合杀虫基因的分子设计、构建及表达研究[D];中国农业科学院;2000年
4 谭芙蓉;四川生态区苏云金芽胞杆菌资源的筛选鉴定及其新型杀虫基因的克隆表达研究[D];四川农业大学;2008年
5 朱军;四川盆地苏云金芽胞杆菌cry和cyt基因的鉴定及其新型模式cry基因研究[D];四川农业大学;2010年
6 付祖姣;苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究和高效杀虫工程菌的构建[D];湖南师范大学;2008年
7 鲁松清;苏云金芽胞杆菌对鳞翅目昆虫广谱高毒基因工程菌的构建[D];华中农业大学;1999年
8 闫贵欣;对金龟甲科、叶甲科害虫高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫基因及工程菌的研究[D];中国农业科学院;2009年
9 张利莉;苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1D的表达调控[D];华中农业大学;2000年
10 张琼;苏云金芽胞杆菌蛋白Aii及其对植物病原菌致病性的影响[D];华中农业大学;2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈志芳;新杀虫微生物资源筛选利用研究[D];南京师范大学;2005年
2 雷会霄;苏云金芽孢杆菌的分离鉴定及杀虫基因的克隆[D];河北农业大学;2010年
3 杜孟芳;杀光肩星天牛Anoplophra glabripennis (Motsch.) Bt菌株的筛选及其杀虫基因的克隆[D];河南农业大学;2002年
4 张彦蕊;苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究[D];中国农业科学院;2012年
5 苏俊平;苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及高毒力菌株的研究[D];河北农业大学;2012年
6 王珣;Bt、CPTI双价杀虫基因对水稻遗传转化的研究[D];东北农业大学;2003年
7 解维星;对韭蛆具生物活性的Bt的筛选及其特性研究[D];华中农业大学;2007年
8 郭靖;对鳞翅目害虫具有高毒力的Bt菌株筛选[D];东北农业大学;2012年
9 李云艳;雅安周公山苏云金芽胞杆菌基因资源研究和杀虫基因的克隆[D];四川农业大学;2008年
10 逯晋忠;苏云金芽胞杆菌对云斑天牛的抗性研究[D];华中农业大学;2010年
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