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miR-206对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响研究

鲁明  
【摘要】:microRNA (miRNA)是真核生物中一类约22bp大小的的非编码RNA小分子,通过与靶基因mRNA3端非翻译区特异性的结合而导致靶mRNA的降解或者抑制其翻译,从而对基因表达进行转录后调控,是一类重要的调节因子。microRNA (miRNA)参与的生命过程包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡及细胞分化等。随着越来越多microRNA的发现以及功能与调节通路的阐明,microRNA已经成为当前生物学领域的研究热点。研究表明,microRNA在肌肉发育过程中也发挥了重要的调控作用。在生物体内microRNA的表达具有组织特异性,一些学者把在肌肉中特异表达的microRNA命名为MyomiRs家族,包括miR-1、miR-133a、miR-206等等。MyomiRs的大部分成员在心肌和骨骼肌中都有表达,但是只有miR-206为骨骼肌特异性表达,所以本实验选择骨骼肌特异性的miR-206为研究对象。 本文以原代培养的牛骨骼肌卫星细胞为实验材料,通过Real Time PCR检测正常培养的牛骨骼肌卫星细胞在分化不同时期miR-206的表达量。同时通过转染miR-206的真核表达载体研究miR-206对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响,结果表明: 使用胶原酶XI与胰蛋白酶相结合的方法,经过差速贴壁成功分离了原代牛骨骼肌卫星细胞。细胞生长状态良好,在含有2%马血清的培养基诱导下,细胞能够分化并融合形成多核的肌管;分化效率较高,免疫荧光染色显示细胞内骨骼肌标志性分子呈阳性表达。 实时荧光定量PCR技术验证miR-206在牛骨骼肌卫星细胞分化不同时期呈现出差异表达的情况,在未分化细胞中表达量最低,随着分化时间的延长其表达量逐渐上调,在第五天表达量为最高。通过转染真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-206与对照组相比,过表达miR-206对牛骨骼肌卫星细胞有促进分化的作用。C2C12细胞是体外分化的理想模型,同样我们检测其分化不同天数miR-206的表达情况,实验结果显示miR-206的表达水平也是在第五天为最高。 通过生物信息学方法预测分析得出miR-206调控的靶基因为PAX3。通过RT-PCR扩增出PAX3基因包含靶位点的3'-UTR区域,双荧光报告证明PAX3是miR-206的靶基因。 本实验的研究结果初步探索miR-206在牛骨骼肌卫星细胞中的作用,为今后进一步研究MyomiRs家族在牛肌肉生长发育中的功能与调控机制奠定了实验基础和提供了理论依据。


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