保加利亚乳杆菌代谢组学样品的前处理研究

【摘要】：乳酸菌在食品工业中有悠久的历史，已被广泛应用于乳制品、肉制品、青贮饲料、谷物和果蔬等的加工生产中，解析其生理代谢特性对于改善菌株的生产性状具有重要的指导意义。研究其代谢组学需要可靠的、可重现的和全面的分析细胞内具有较宽动力学浓度范围和化学功能各异的代谢产物，这就对从采样、淬灭、代谢产物的提取到代谢物的定量分析这整个实验过程提出了严格的要求。本研究以具有重要工业应用价值的保加利亚乳杆菌为研究对象，构建了小型快速取样装置，筛选了简单、快速的评价淬灭时代谢物泄露的指标，比较了三种淬灭液造成的代谢物泄露情况，并首次尝试了冷热结合提取法。该研究成果可为乳酸菌代谢组学的采样、淬灭和提取研究提供理论依据，从而有助于完善乳酸菌代谢的生理学和遗传学概貌。 1、构建代谢组学快速取样装置 本研究构建的自动快速取样装置主要包括空气压缩机，三通电磁阀、微控制器和采样管等。通过控制空气的压力和通气时间，来调整采样体积，采样间隔时间可小于5s。同时，可根据实验需要在收集管内装有淬灭剂和干冰等冷却剂，即可对进入的生物样本进行即时淬灭和快速降温。 2、淬灭方法的比较分析 本研究通过分析菌体细胞的完整性和胞内代谢物的泄露率，评价了60%甲醇/水（-40°C）、80%甲醇/水（-40°C）和80%甲醇/甘油（-40°C）三种淬灭方式。由流式细胞实验、OD回收率实验和气质联用（GC-MS）实验发现三种淬灭液都造成了胞内代谢物泄露，但是高浓度的80%冷甲醇/水有助于减轻胞内代谢物泄露的发生。虽然甘油也可以减少胞内代谢物的泄露，但因其难以被除去且掩盖了很多其它的代谢物，并不适于GC-MS分析。另外，酶法检测LDH的实验结果与整体趋势相矛盾，推测LDH可能不适于作为评价代谢物泄露的科学指标。细胞完整性可以作为评价淬灭时代谢物泄露的简便指标。 3、提取方法的比较分析 代谢组学提取要求最大程度和最大范围的提取代谢物，从而真实的反映胞内代谢情况。本研究比较了目前常用的冷甲醇液氮冻融法和热乙醇提取法，并尝试了新的提取方法--冷热结合提取法。通过GC-MS检测和多元统计分析，包括PCA，OPLS-DA和差异代谢物，发现冷甲醇法提取氨基酸和短链有机酸类的效率优于热乙醇提取法，热乙醇法提取长链有机酸和糖类的效率优于冷甲醇法，两种提取方法各有自身的提取特点。而新的冷热结合法在提取氨基酸、有机酸类和糖类等方面的效率介于冷甲醇提取法与热乙醇提取法之间，提取其它类代谢物方面超越了冷甲醇液氮冻融和热乙醇法，并保留了冷甲醇提取法和热乙醇法的提取特点。从获得的GC峰数量来看，GC-MS检测到冷热结合法有131个GC峰，超过了冷甲醇法（91个）和热乙醇法（104个）。由此可见，新的冷热结合提取法具有一定优势。